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内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室2014.05
干酪乳杆菌Zhang(Lactobacillus casei Zhang，L. casei Zhang)是 内蒙古农业大学―乳品生物技术与工程‖教育部重点实验室研究人员于2001年从内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶样品中分离筛选出的1株性能卓越的益生菌。研究人员采用体外实验、动物模型和人体试验对Lactobacillus casei Zhang 的益生功能进行了系统评价(图1)，并利用基因组学、蛋白质组学和转录组学的手段对 Lactobacillus casei Zhang的益生机制进行了深入剖析。经过多年系统的基础研究，自主解决了其产业化的关键技术问题，包括直投式发酵剂、发酵乳制品、发酵豆乳益生菌饮料、益生菌固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等产品，并实现了产业化。相关研究开发报告分类目录如下：
1． Lactobacillus casei Zhang的分离与筛选
2． Lactobacillus casei Zhang的益生功能评价
a) Lactobacillus casei Zhang对高脂血症大鼠脂质代谢的影响
b) Lactobacillus casei Zhang对机体抗氧化能力的影响
c) Lactobacillus casei Zhang对肝损伤的改善保护作用
d) Lactobacillus casei Zhang对糖耐量受损改善作用和Ⅱ型糖尿病的预防作用
e) Lactobacillus casei Zhang对病原性大肠杆菌的拮抗作用
f)Lactobacillus casei Zhang的免疫调节作用
g) Lactobacillus casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响
h) Lactobacillus casei Zhang在人体肠道中的定植及对肠道菌群的影响
3． Lactobacillus casei Zhang基因组学及蛋白质组学研究
4． Lactobacillus casei Zhang稳定性研究
5． Lactobacillus casei Zhang直投式发酵剂的开发及产业化
6． Lactobacillus casei Zhang在发酵乳制品和发酵豆乳制品中的研究开发及产业化
7． Lactobacillus casei Zhang在益生菌固体饮料、益生菌片剂及益生菌胶囊等健康食品中的研究开发及产业化
8． Lactobacillus casei Zhang研究开发获得的奖励
9． Lactobacillus casei Zhang相关的发明专利和发表的研究论文
图1 Lactobacillus casei Zhang的益生功能
Lactobacillus casei Zhang研究开发摘要
1. Lactobacillus casei Zhang的分离与筛选[1-10]
Lactobacillus casei Zhang是2001年分离自内蒙古锡林郭勒盟正蓝旗草原上自然发酵酸马奶（Komiss）中的一株具有优良益生特性的干酪乳杆菌（图2~图7）。
酸马奶是以新鲜马奶为原料，经乳酸菌和酵母菌等微生物共同自然发酵形成的酸性、低酒精含量乳饮料，在蒙古族中已有几千年的制作和食用历史。几千年的蒙医临床实践表明，酸马奶对胃肠道、心血管和呼吸道疾病具有明显的辅助治疗作用。
图2 内蒙古锡林郭勒草原 图3 牧民挤马奶
图4马奶自然发酵 图5 采集自然发酵酸马奶样品
图6 L. casei Zhang菌种保藏 图7 L. casei Zhang扫描电镜图
Lactobacillus casei Zhang是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库(中国第一个最大的原创性乳酸菌菌种资源库，保藏乳酸菌3,388株)保藏的243株分离自自然发酵酸马奶中的乳杆菌中优选的1株具有优良益生特性的乳杆菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、胆盐和牛磺胆酸钠水解能力。
Lactobacillus casei Zhang在pH2.0的人工胃液中消化3小时后继续在pH8.0的人工肠液中消化24小时后的存活率高达73.5% (图8)。Lactobacillus casei Zhang可耐受的最大胆盐浓度为1.6g/100mL，其对Caco-2细胞的黏附率为4.31%，对牛磺胆酸钠解共轭所产生的游离胆酸量为2.28mM/L。
图8 L. casei Zhang在人工消化系统中的耐受能力
利用Lactobacillus casei Zhang全基因组芯片，对发酵乳Lactobacillus casei Zhang菌体和单纯Lactobacillus casei Zhang菌体通过人工胃肠液的转录谱进行了分析(图9)，结果表明，存在于发酵乳中的菌体与纯菌体转录谱差异显著。与发酵乳中的菌体转录谱相比，无发酵乳保护纯菌体的转录谱中大量的基因表达显著上调，说明单纯的菌体在通过人工胃肠道时会面临较多应激因素；与此相反，大部分编码核糖体蛋白、氨基酰-tRNA合成酶以及ATP结合转运蛋白的基因表达显著下调控。这一研究结果与无发酵乳保护情况下菌体细胞存活率较低的研究结果相一致。
图9 L. casei Zhang纯菌体和发酵乳保护下的菌体在人工胃液中转运的差异表达基因功能分类
2. Lactobacillus casei Zhang的益生功能评价
2.1 Lactobacillus casei Zhang对高脂血症大鼠脂质代谢的影响[11-13]
高脂血症大鼠摄食Lactobacillus casei Zhang(2.0×108CFU/d) 30d后，大鼠血液中的甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的含量分别下降了31.3%和30.8%；肝脏组织中的总胆固醇(TC)和甘油三酯(TG)的含量分别下降了20.4%和17.5%(图10)，同时Lactobacillus casei Zhang可以调节血液中载脂蛋白的代谢，并可显著增加粪便中总胆汁酸的排出。这一研究结果表明，Lactobacillus casei Zhang可显著改善高脂血症动物的脂质代谢，具有良好的降血脂作用。
为了深入研究Lactobacillus casei Zhang降血脂作用的分子机制，利用DNA芯片技术对大鼠肝脏组织的基因表达进行了分析(图11)。结果表明：摄食Lactobacillus casei Zhang大鼠肝脏组织中与脂肪酸氧化相关的5个基因(包括长链脂肪酸连接酶、羟酰辅酶 A脱氢酶、乙酰辅酶A乙酰基转移酶、酰基辅酶A脱氢酶和戊二酰-辅酶 A脱氢酶)的表达量显著升高(p<0.05)< span="">，这表明Lactobacillus casei Zhang可以加速脂肪酸的氧化进而促进TG的分解代谢从而起到降血脂的作用。
图10 L. casei Zhang可显著降低血液中总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）
及低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）含量，显著提升高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）含量
图11 高脂血症大鼠喂食L. casei Zhang后肝脏中差异表达基因的功能分类
2.2 Lactobacillus casei Zhang对机体抗氧化能力的影响[14-15]
用Lactobacillus casei Zhang饲喂大鼠28d(2.0×108 CFU/d)，与对照组相比，Lactobacillus casei Zhang可使大鼠肝脏组织中的总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱苷肽过氧化物酶(GSH-Px)活力极显著提高( P<0.01)< span="">，血清谷草转氨酶(GOT)和谷丙转氨酶(GPT)水平显著降低(P<0.05)< span="">。大鼠肝脏组织中的氧化产物---丙二醛(MDA)浓度极显著降低(P<0.01)< span="">。这一结果说明Lactobacillus casei Zhang可提高机体的抗氧化能力（图12、图13）。
图12 喂食L. casei Zhang后大鼠肝脏照片和组织切片图
组 A， B 和 C分别为正常对照组、高脂血症模型组和正常预防组。组A和组C饲喂正常饲料，其余组饲喂高脂饲料。组D、E和F为饲喂由低到高不同剂量L. casei Zhang 的干预治疗组。组C、D、E和F中饲喂L.casei Zhang的
2.3 Lactobacillus casei Zhang对肝损伤的改善保护作用[16、17]
以酒精性肝损伤大鼠为模型，用Lactobacillus casei Zhang喂饲大鼠30d(低剂量组L ：1.0×108 CFU/d、中剂量组M ：2.0×108 CFU/d、高剂量组H ：1.5×109 CFU/d)，同时灌服65度白酒7g/(kg.bw.d)；对照组不喂饲Lactobacillus casei Zhang，只灌服65度白酒7g/(kg.bw.d)
结果显示：Lactobacillus casei Zhang可显著降低肝脏中碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)的活性(P<0.01)< span="">；同时调节大鼠肝脏组织中CYP3A1/GAPDH、CYP3A2/GAPDH和CYC/GAPDH的基因表达水平，起到保护肝脏的作用。试验数据见图14、图15。
图15 L. casei Zhang可有效修复酒精性肝损伤肝
以脂多糖和D-半乳糖诱发肝损伤（LPS/D-GalN）大鼠为模型，用Lactobacillus casei Zhang喂饲大鼠30d(1.0×109 CFU/d)，试验设计对照组(CTRL)、LPS/D-GalN组（L/G）、LPS/D-GalN+Lactobacillus casei Zhang组（L/G+LCZ）和LPS/D-GalN+地塞米松组（L/G+DXM）。结果显示：Lactobacillus casei Zhang能够显著减低L/G组动物肝脏丙氨酸转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平，同时降低丙二醛（MDA）含量，提高超氧化物歧化酶（SOD）活性。降低肝脏NO的含量及NO合成酶（INOS）的活性、降低肿瘤坏死因子(TNF-α)的表达。此外，Lactobacillus casei Zhang能显著减低肝脏TLR4的表达以及蛋白质水平、磷酸化的I-κB和核因子NF- κB的转运。
这些结果表明Lactobacillus casei Zhang通过抗氧化和抗炎症的益生特性能够保护由脂多糖和D-半乳糖引起的肝损伤。部分试验数据见图16-18。
图18 L. casei Zhang可以有效保护肝脏
2.4 Lactobacillus casei Zhang对糖耐量受损改善作用和Ⅱ型糖尿病预防作用[18]
采用高果糖水诱导SD大鼠高胰岛素血症合并糖耐量受损来评价益生菌Lactobacillus casei Zhang（1.0×109 CFU/d·只）的预防及改善作用。试验分为正常组（NC）、预防组（LP）和对应模型组（HMⅠ）、治疗组（LT）和对应模型组（HMⅡ）5个组。
结果表明， Lactobacillus casei Zhang可以显著预防和改善糖耐量受损，并显著提高肠道乳杆菌和双歧杆菌数量和显著降低肝糖原含量和梭菌数量（p<0.05< span="">）。在预防作用中，LP组体重、血清胰岛素水平和GLP-2水平明显低于HMⅠ组（p<0.05< span="">）。在治疗作用中，LT组肠道Bacteroides fragilis 数量、血清骨钙素水平、肝脏AdipoR2、LXR-α和PPAR-γ mRNA水平均显著高于HMⅡ组，而MDA水平显著低于HMⅡ组（p<0.05< span="">），部分数据见图19。
以Ⅱ型糖尿病大鼠为模型，对试验大鼠（正常对照组、预防组（从试验前21d开始喂饲Lactobacillus casei Zhang (4.0×109 CFU/d)直至试验结束）、Ⅱ型糖尿病模型组）进行了为期42d的试验，试验结果表明：预防组与Ⅱ型糖尿模型组相比空腹血糖和餐后2小时血糖水平都明显降低(P<0.01< span="">)，而且预防组的糖耐量水平与模型组相比也得到显著改善(p<0.01< span="">)。Lactobacillus casei Zhang可以显著降低血液中内毒素和总12 / 45
胆汁酸水平(p<0.05< span="">)，显著降低诱导型NO合成酶（INOS）活性(p<0.05< span="">)。起到预防Ⅱ型糖尿病的作用，试验数据见图20、图21。
益生菌Lactobacillus casei Zhang可以对糖耐量受损大鼠口服糖耐量曲线AUC表现出良好的预防和改善作用，同时对大鼠Ⅱ型糖尿病的形成和疾病发展有着良好的预防作用。但具体机制存在一定差异。
对糖耐量受损的预防机制主要可能是Lactobacillus casei Zhang可以减少肠道对大量果糖的吸收以及降低GLP-2水平从而降低体重和胰岛素水平。
而对糖耐量受损的治疗改善机制主要可能是摄入Lactobacillus casei Zhang可以保持肠道中较高数量的维生素K2主要产生菌Bacteroides fragilis，这样可以增加骨钙素水平，从而改善口服糖耐量水平。Lactobacillus casei Zhang对Ⅱ型糖尿病及相关并发症的预防机制主要可能是Lactobacillus casei Zhang可以减少7α脱羟基活性肠道细菌的数量，这样增加粪便总胆汁酸水平，进而促成体内胆汁酸与氯离子的交换，从而发生各器官氯离子的内流以及氯相关蛋白表达的增加，最终整体上增强了大鼠体质和免疫水平(图22)。
2.5 Lactobacillus casei Zhang对病原性大肠杆菌的拮抗作[19-21]
用Lactobacillus casei Zhang饲喂小鼠15d(4.0×107 CFU/d)，然后分别用E. coli O157和E. coli K88对小鼠进行攻毒，试验结果表明，摄食Lactobacillus casei Zhang可以使攻毒后小鼠的存活率由33.4%提高至 94.4%(图23)。
攻毒4天后取对照组和实验组未死亡小鼠的肠内容物，用选择性培养基分离纯化大肠杆菌和乳酸菌，并进行基因组ERIC-PCR扩增分析，结果表明停止饲喂Lactobacillus casei Zhang的第4天从小鼠肠道内仍然能分离Lactobacillus casei Zhang，但未分离到E. coli O157和K88，饲喂Lactobacillus casei Zhang可使小鼠肠道中大肠杆菌总数明显低于对照组( p<0.01)< span="">，上述研究结果表明Lactobacillus casei Zhang可以在小鼠肠道内定植并能起到拮抗病原菌的作用(图24)。
图24 L. casei Zhang可显著降低攻毒小鼠肠道中E. coli O157和E. coli K88含量
（M：DL2000 Maker；1：E. coli O157；2：E. coli K88；3-16：各试验组小鼠肠道中大肠杆菌。）
2.6 Lactobacillus casei Zhang的免疫调节作用 [22-29]
用Lactobacillus casei Zhang喂饲小鼠15d(低剂量组（L dose）：2.5×108 CFU/d、中剂量组（M dose）：5.0×108 CFU/d、高剂量组（H dose）：1.0×109 CFU/d)，结果表明：Lactobacillus casei Zhang可明显上调血液中IFN-γ和IL-12 水平(P<0.05)< span="">，下调 IL-1α和TNF-α水平(P<0.01)< span="">，见图25。
同时Lactobacillus casei Zhang可显著提高小鼠外周血中 CD3+、CD4+、CD8+的比例(P<0.01)< span="">，并可显著增加小鼠血清IgG的含量和小鼠肠黏膜SIgA的含量(P<0.01)< span="">，并可显著提高肠粘膜内 CD3+、IgA+细胞数量及表达强度(P<0.01) ，部分研究结果见图26。
小鼠摄食Lactobacillus casei Zhang菌体7d后，与对照组相比，小鼠肠粘膜相关淋巴组织中Peyer’s结计数、计分值显著提高(P<0.01)< span="">，对照组、低剂量组（2.5×108 CFU/d）、中剂量组（5.0×108 CFU/d）、高剂量组（1.0×109 CFU/d）小鼠肠粘膜相关淋巴组织中Peyer’s结计分值分别为：5.85、7.98、8.59、8.37，部分研究结果见图27。
上述研究表明：Lactobacillus casei Zhang对小鼠的细胞免疫、体液免疫及肠黏膜局部免疫具有调节功能。
图25 L. casei Zhang具有显著的免疫调节作用
结果表明Lactobacillus casei Zhang能够促进巨噬细胞NO、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白细胞介素(IL)-6以及干扰素(IFN)- β的分泌，还能够提高NO合成酶的转录。此外，Lactobacillus casei Zhang活菌能够显著抑制聚肌胞苷酸诱导的NO、iNOS和TNF- α的表达，并提高TNF- β的表达，能够显著上调聚肌胞苷酸诱导的干扰素调节因子3(IRF3)基因的表达活性。
Lactobacillus casei Zhang能够通过增加巨噬细胞中Toll受体的表达、增强促炎调节因子的分泌以及Ⅰ型干扰素的分泌，进而保持先天免疫系统的敏感性。部分数据见图28、图29。
2.7 Lactobacillus casei Zhang对H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响[30-33]
以H22荷肝癌瘤小鼠为模型，用Lactobacillus casei Zhang喂饲小鼠12d(低剂量组（L dose）：2.5×108 CFU/d、中剂量组（M dose）：5.0×108 CFU/d、高剂量组（H dose）：1.0×109 CFU/d)。结果显示：摄食Lactobacillus casei Zhang组的巨噬细胞吞噬百分率、吞噬指数、小鼠血清中肿瘤坏死因子(TNF-β)含量与对照组比较均有显著提高(P<0.01)< span="">；Lactobacillus casei Zhang菌体对H22移植性肿瘤的生长具有显著的抑制作用，抑瘤率为40.22% (P<0.01)< span="">，部分试验数据见图30。
实验组H22肿瘤细胞癌基因Bcl-2蛋白表达明显降低，而抑癌基因Bax蛋白表达增强，与荷瘤对照组相比差异显著(P<0.01)< span="">。Lactobacillus casei Zhang抗肿瘤机制可能是通过增强荷瘤小鼠免疫功能及同时促进肿瘤细胞Bax蛋白表达、抑制Bcl-2表达以及诱导肿瘤细胞凋亡从而发挥抗肿瘤的作用(图31，图32)。
casei Zhang Contorl L.
癌基因Bcl-2在H22肿瘤细胞中的表达情况（H dose组）
Contorl L. casei Zhang
抑癌基因Bax在H22肿瘤细胞中的表达情况（H dose组）
图32 L. casei Zhang抑制癌基因Bcl-2表达及促进抑癌基因Bax表达的肝脏组织切片图
2.8 Lactobacillus casei Zhang在人体肠道中的定植及对肠道菌群的影响[34-35]
为了评估Lactobacillus casei Zhang对人肠道菌群多样性的影响，本研究征集了24名健康志愿者并依据年龄将24人分为老年组（E group 7人，平均年龄65.7岁），中年组（M group 7人，平均年龄42.1岁）和青年组（Y group, 10人，平均年龄25.7岁）三组。在试验期间，志愿者连续28天每天食Lactobacillus casei Zhang 4.0×1010 CFU，并于0天、14天、28天、停止服用后的1周（35天）和2周（42天）采集志愿者粪便进行相关指标的测定。应用菌株特异性引物荧光定量 PCR ( Strain Specific Primer RT-PCR)、种属特异性引物荧光定量 PCR ( Species Specific Primer RT-PCR)技术和454焦磷酸测序技术综合分析评价该菌株在人体肠道的存活定植以及对人体肠道菌群多样性的影响。
结果表明，食用Lactobacillus casei Zhang 28天时，Lactobacillus casei Zhang在志愿者粪便中平均含量为8.55 log10 CFU/g，停止食用2周时为5.52 log10 CFU /g，这说明Lactobacillus casei Zhang不仅可以在人体肠道中存活，而且可以在人体肠道中定植并繁殖 (图33)。
Lactobacillus casei Zhang可以显著增加人体肠道中双歧杆菌属(p<0.01)< span="">和奇异菌属(p<0.0001)< span="">的数量，显著减少梭菌属的数量 (p<0.01)< span="">，拟杆菌数量变化并不显著(图34)。
应用454焦磷酸测序对食用Lactobac illus casei Zhang的志愿者肠道内菌群构成进行分析，共分析了72份样品（24位志愿者，采集每位志愿者食用前、食用中、食用后3份样品），平均每份样品得到20,749条16S rRNA序列，共得到1,493,928条高质量的16S rRNA序列。通过Unweighted UniFrac 聚类分析，发现不同年龄段的人群肠道微生物构成差异显著（p<0.001< span="">），食用Lactobacillus casei Zhang 期间各个年龄段人体肠道菌群构成与食用前相比差异显著（p < 0.001），研究结果见图35。
中年人服用Lactobacillus casei Zhang后肠道菌群结构趋向于青年人的肠道菌群结构（P<0.001< span="">），此结果说明服用Lactobacillus casei Zhang可以使肠道菌群结构年轻化（图36、图37）。
焦磷酸测序结果也表明：食用Lactobacillus casei Zhang后人体肠道内有益菌群(Bifidobacterium和Lactobacillus)数量显著增加，而致病菌以及潜在致病菌(Clostridium，Escherichia和Serratia)数量有效减少，使肠道菌群趋于健康化 (图38、图39)。
3.acillus casei Zhang基因组学及蛋白质组学研究[36-49]
3.1 Lactobacillus casei Zhang基因组学研究
2008年，采用全基因组鸟枪法测定 Lactobacillus casei Zhang全基因组序列并进行了功能基因组学分析。结果表明：该菌株的基因组由 1条染色体(GenBank登录号：CP001084)和1个质粒 plca36(GenBank登录号：CP000935)组成。Lactobacillus casei Zhang基因组富含双组分调节系统和糖代谢相关基因，基因组中包括大量的磷酸转移酶系统和一个在乳酸菌中独有的肌醇代谢基因簇，且编码一个典型 relBE毒素-抗毒素系统，可能对该菌株适应复杂生存环境有着重要作用。此外，Lactobacillus casei Zhang还编码2个特有胞外多糖合成基因簇和 6个粘液结合相关蛋白，具备合成胞外多糖和粘附定植的遗传学特点（图40）。该菌株是我国第1株完成全基因组测序的乳酸菌，标志着我国益生乳酸菌的研究进入了基因组时代。
图40 L. casei Zhang全基因组图谱
3.2 Lactobacillus casei Zhang蛋白质组学研究
利用双向电泳技术在国际上首次建立了干酪乳杆菌不同生长时期蛋白质表达图谱，Lactobacillus casei Zhang有48种蛋白在不同生长阶段的表达变化明显，主要包括代谢及应激相关蛋白，可能有助于Lactobacillus casei Zhang在稳定期适应环境变化，增强其抗逆能力(图41)。
图41 L. casei Zhang 在不同生长阶段2-DE图谱
利用蛋白质组研究技术对Lactobacillus casei Zhang在酸和胆盐胁迫下差异表达蛋白质进行了研究。结果表明，在胆盐胁迫下有26种蛋白表达发生显著变化，主要包括分子伴侣、糖代谢、转录调控、氨基酸代谢和氨基糖代谢相关蛋白；在酸胁迫下有15种蛋白表达发生显著变化，主要包括分子伴侣、脂类代谢和转录调控相关蛋白。两种不同胁迫环境诱导部分类同蛋白表达发生变化，说明该菌株应对胆盐和酸胁迫环境可能有共同的调控机制（图42）。
0代 1000代
图43 Lactobacillus casei Zhang革兰氏染色显微照片
5. Lactobacillus casei Zhang直投式发酵剂的开发及产业化[51-58]
采用RT-PCR技术系统地研究了Lactobacillus casei Zhang在不同发酵条件和发酵不同阶段 16个关键酶基因表达模式的变化，包括葡萄糖激酶、 β-葡萄糖苷PTSE II、磷酸-丝氨酸结合蛋白磷酸化酶等，建立了Lactobacillus casei Zhang在高密度发酵过程中的代谢分子机制（图44）。根据Lactobacillus casei Zhang的代谢分子机制和营养需求，对增菌培养基成分和含量进行筛选和优化，确定了Lactobacillus casei Zhang的高密度发酵工艺，发酵液活菌数大于 2.0×1010 CFU/mL(图45)。
抗冷冻方面的研究中，发现冷冻干燥过程中糖类的添加对 Lactobacillus casei Zhang细胞膜的zeta电位、疏水性、流动性和完整性均有不同程度的影响，在此基础上开发出了适合Lactobacillus casei Zhang冷冻干燥过程中有效的抗冻保护剂。
基于上述研究，Lactobacillus casei Zhang 经真空冷冻干燥可得到活到活菌数2.0×1011 CFU/g以上的高活力发酵剂，可以满足益生菌制剂和各类发酵制品的要求。
2010年 6月，合作企业投资6000万人民币，成功的将Lactobacillus casei Zhang发酵剂进行了工业化生产，产品中活菌数大于2.0×1011 CFU/g，达到国际同类产品水平（图46～图49）。
图46 3000余平方米的GMP生产车间 图47 L. casei Zhang 高密度发酵系统
图48 全自动控制系统 图49 L. casei Zhang发酵剂品质控制
6. Lactobacillus casei Zhang在发酵乳制品和发酵豆乳制品中的研究开发及产业化[59-81]
6.1 Lactobacillus casei Zhang在牛乳和豆乳中的发酵及贮藏特性的研究[59、60]
将Lactobacillus casei Zhang按1.0×107CFU/mL接种量接种于牛乳中，37℃恒温发酵，结果显示，至发酵终点（pH 4.5）时，其活菌数为1.0×108 CFU/mL；将发酵乳4℃贮藏28天，其活菌数可保持1.0×108 CFU/mL以上，发酵乳具有良好的口感和风味（图50、图51）；并且， Lactobacillus casei Zhang可以有效抑制霉菌和酵母菌对发酵乳的后期污染（图52）。
将Lactobacillus casei Zhang按1.0×107CFU/mL接种量接种于豆乳中，37℃恒温发酵，至发酵终点（pH 4.5）时，其活菌数可达1.3×109 CFU/mL（图53），4℃贮藏 28天期间，Lactobacillus casei Zhang在豆乳中活菌数仍保持在1.0×109CFU/mL，活菌数无明显降低（P<0.01< span="">）。这一结果说明豆乳更加适合Lactobacillus casei Zhang的生长。
图53 L. casei Zhang 在豆乳和牛乳发酵过程中pH 及活菌数的变化情况
为了探明Lactobacillus casei Zhang在豆乳中生长的分子机理，利用Lactobacillus casei Zhang全基因组基因芯片和蛋白质组技术对其在牛乳和豆乳发酵过程中进行了转录组学和蛋白质组学比较分析。
转录组学分析结果表明：Lactobacillus casei Zhang在牛乳中生长和发酵过程中，在稳定生长期较对数生长期共有84个基因显著表达， 其中59个表达显著上调控基因中（P<0.05< span="">），40.5%与碳水化合物和能量代谢相关；而在豆乳生长和发酵过程中，对数生长期较迟滞生长期有162基因表达显著不同（P<0.05< span="">），稳定生长期较对数生长期有63个基因表达显著不同（P<0.05< span="">），其中对数生长期48.6%的表达上调控基因与氨基酸的转运和代谢有关，稳定生长期48.8%的表达上调控与氨基酸转运和代谢相关（图54）。
蛋白质组学分析表明：Lactobacillus casei Zhang 在豆乳中生长， 较牛乳共有144 个差异表达蛋白点，其中迟滞生长期34 个，对数生长期64 个，稳定生长期46 个，三个时期表达上调控蛋白点分别为24 个、34 个和33 个，编码这些表达上调控蛋白质的基因主要参与氨基酸和核苷酸的转运和代谢（图55）。
进一步分析表明：Lactobacillus casei Zhang在牛乳生长过程中，主要上调控基因与PTC系统和磷酸戊糖途径PPP相关；而在豆乳生长过程中，主要上调控基因与蛋白水解酶系统、氨基酸和核苷酸代谢相关，尤其是蛋白水解酶系统的活跃表达，使得Lactobacillus casei Zhang在豆乳能够分解大豆蛋白质为自身的生长提供充足氨基酸和核苷酸，这可能是其在豆乳中生长优于牛乳的主要原因。
图55 L. casei Zhang在牛乳和豆乳发酵过程中不同时期的蛋白质表达图
6.2 Lactobacillus casei Zhang发酵豆乳饮料、发酵乳及活性乳酸菌饮料中的产业化应用
根据上述基础研究数据，建立并优化了Lactobacillus casei Zhang发酵乳和发酵豆乳益生菌饮料的生产工艺。2010年，采用独特的2段发酵工艺，Lactobacillus casei Zhang益生菌发酵豆乳饮料—百益多(Lactobacillus casei Zhang与Bifidobacterium lactis V9共同发酵 )在青岛君益食品有限公司投产，产品中活菌（Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9）达到 580亿CFU/100mL，是目前我国市场上益生菌饮料中最高活菌数的5倍，且在货架期内活菌数一直保持不变，产品见图56。
图56 益生菌发酵豆乳饮料—百益多
2011年，Lactobacillus casei Zhang陆续地应用于内蒙古伊利集团 QQ星儿童益生菌乳饮料、轻果激扬活性益生菌饮料、U益益生菌饮料中，伊利集团相关产品见图57。
7. Lactobacillus casei Zhang在益生菌固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等健康食品中的应用与产业化
根据Lactobacillus casei Zhang优良的益生特性和贮藏稳定性，北京和美科盛生物技术有限公司推出了含有Lactobacillus casei Zhang的复合益生菌片—益生和美(含L. casei Zhang、B. lactis V9和L.plantarum P-8，总活菌数大于3000亿CFU/100g，其中含L. casei Zhang含量大于1000亿CFU/100g)（图58）。
图58复合益生菌片剂—益生和美
北京中研万通科技中心营养食品公司陆续推出了含有Lacto- bacillus casei Zhang的复合益生菌冻干粉—给力1号(含Lactobacillus casei Zhang高达1000亿CFU/100g)和复合益生菌胶囊—肠寿(含Lactobacillus casei Zhang高达1000亿CFU/100g)，产品见图59、图60。
北京灵君康美生物科技有限公司陆续推出了含有Lactobacillus casei Zhang的超级益生菌组合—LA片剂(含Lactobacillus casei Zhang高达1000亿CFU/100g)和LA固体饮料(含Lactobacillus casei Zhang高达2500亿CFU/100g)，产品见图61、图62。
8. Lactobacillus casei Zhang研究开发获得的奖励
(1) 2009年，―功能性益生乳酸菌高效筛选及应用关键技术‖获国家科技进步二等奖（证书号：2009-J-251-2-10-D04），证书见图63。
(2) 2011年，―益生菌Lactobacillus casei Zhang—从基础研究到产业化开发‖获教育部高等学校科技进步二等奖（证书号：2011-249），证书见图64。
(3) 2010年，―益生菌Lactobacillus casei Zhang的筛选及基因组学和蛋白质组学的研究‖获内蒙古自治区自然科学一等奖（证书号：2009-Z-001-1-01-D1），证书见图65。
(4) 2009年，―益生菌Lactobacillus casei Zhang基因组学和蛋白质组学的研究‖获第六届大北农科技成果奖（国家奖社字第0149号），证书见图65。
图63 L. casei Zhang的研究开 图64 L. casei Zhang的研究开发成果获
发成果获教育部科技进步二等奖 成果获国家科技进步二等奖
图65 L. casei Zhang的研究开发成果获内蒙古自治区自然科学一等奖和第六届大北农科技成果奖
9. Lactobacillus casei Zhang相关的发明专利和研究论文授权发明专利11项（截止到2014年5月）：
(1) 发明人：张和平、孟和毕力格；申请日：2006 年9 月8 日；发明名称：一种干酪乳杆菌及其在改善血脂代谢和免疫调节中的应用；专利号：ZL 2006 1 0126889.3；授权公告日：2010 年5 月12 日；
(2) 发明人：张和平、陈霞、孟和毕力格、孟和；申请日：2007 年7 月20 日；发明名称：一种H+-ATP酶耐酸基因atpA和包括该基因的干酪乳杆菌；专利号：ZL 2007 10129939.8；授权公告日：2010 年12 月22 日；
(3) 发明人：张和平、王俊国、孟和毕力格；申请日：2007 年6 月26 日；发明名称：一种干酪乳杆菌在抗氧化作用方面的应用；专利号：ZL 2007 1 0109474X；授权公告日：2011 年01 月12 日；
(4) 发明人：张和平、高鹏飞、崔景丽、孟和毕力格；申请日：2007 年07 月06 日；发明名称：一种干酪乳杆菌及其在固态发酵中的应用；专利号：ZL 2007 1 0118485.4；授权公告日：2011 年04 月06 日；
(5) 发明人：张和平、张文怿、陈霞、孟和毕力格、孟和；申请日：2007 年8 月13 日；发明名称：一种结合胆盐水解酶基因和包括该基因的干酪乳杆菌；专利号：ZL 2007 10143906.9，授权公告日：2011 年06 月22 日；
(6) 发明人：张和平、包秋华、张家超；申请日：2009 年9 月28 日；发明名称：益生菌乳制品中干酪乳杆菌的快速定性、定量检测方法；专利号：ZL 2009 1 0177910.6，授权公告日：2011 年06 月23 日；
(7) 发明人：张和平、陈霞；申请日：2009 年12 月14 日；发明名称：干酪乳杆菌Zhang微胶囊及其制备方法与它们的用途；专利号：ZL 2009 1 0250670.8；授权公告日：2012年02 月01 日。
(8) 发明人：张和平、乌日娜、孟和；发明名称：干酪乳杆菌Zhang中脂酶Est C的蛋白序列；专利号：ZL 2010 1 0122423.2；授权公告日：2012年09 月05 日。
(9) 发明人：张和平、孟和、张文怿、孙志宏；发明名称：干酪乳杆菌Zhang中GroEL的蛋白序列；专利号：ZL 2009 1 0250671.2；授权公告日：2012年11月6日；
(10) 发明人：张和平、孟和 张文怿 孙志宏；发明名称：干酪乳杆菌Zhang中fbpA的蛋白序列；专利号：ZL 2009 1 0250672.7；授权公告日：2013年01月16日；
(11) 发明人：张和平、孟和、张文怿、孙志宏；发明名称：干酪乳杆菌Zhang中Dnak的蛋白序列；专利号：ZL 2009 1 0250673.1；授权公告日：2012年11月21日.
进入审查阶段发明专利8项（截止到2014年5月）：
(1) 发明人：张和平、李妍、高鹏飞、赵文静；申请日：2008 年11 月6 日；发明名称：干酪乳杆菌Zhang高密度培养方法、使用它们制备冻干菌粉的方法与所得到的冻干菌粉及其用途；申请号：200810175856.7；
(2) 发明人：张和平、王记成、郭壮；申请日：2008 年12 月4 日；发明名称：干酪乳杆菌Zhang发酵乳及其制备方法；申请号：200810180275.2；
(3) 发明人：张和平、董成、崔利敏；申请日：2008 年12 月16 日；发明名称：含有干酪乳杆菌Zhang的干酪及其制备方法；申请号：2008101803197.1；
(4) 发明人：张和平、张家超；申请日：2012年12月21日；发明名称：一种Lactobacillus casei Zhang （CGMCC 1697）的检测方法；申请号：201210559154.5；
(5) 发明人：张和平、王记成；申请日：2012年12月21日；发明名称：一种干酪乳杆菌在改善酒精性肝损伤中应用；申请号：201210528510.7；
(6) 发明人：张文羿、张和平；申请日：2013年09月04日；发明名称：一种干酪乳杆菌中谷胱甘肽转硫酚分布规律的快速定性检测方法；申请号：201310395515.1；
(7) 发明人：张文羿、张和平；申请日：2013年09月04日；发明名称：一种干酪乳杆菌中肌醇代谢基因簇的快速定性检测方法；申请号：201310396346.3；
(8) 发明人：高鹏飞、姚国强；申请日：2014年02月01日；发明名称：一种全燕麦固态混菌发酵生产益生菌活菌粉剂及其制备方法；申请号：201410123174.7。
发表的研究论文（截止到2014年5月）：
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3. 张和平, 孟和毕力格, 王俊国, 孙天松, 徐杰, 王立平, 云月英, 乌日娜. 分离
自内蒙古传统发酵酸马奶中 L.casei Zhang潜在益生特性的研究. 中国乳品工业,2006,34(4):4-10.
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京公网安备 11010202008857号
