阴道上皮内瘤变（VAIN）是一种罕见的疾病，包括阴道鳞状上皮不典型增生及阴道原位癌。VAIN继续发展，突破基底膜，即发展为阴道浸润癌。与宫颈上皮内瘤变（CIN）和外阴上皮内瘤变（VIN）相比，VAIN在女性下生殖道上皮内瘤变中最少见（＜1%），仅为CIN的0.6%～1.0%。美国的发病率为（0.2～200）/10万，中国未见确切报道。截至目前，大量研究主要集中在CIN，明确了CINⅠ-CINⅡ-CINⅢ-CC（宫颈癌）的连续性，HPV的致病性，并确立了CIN的治疗方针。目前，对VAIN研究较少，只有少数的几个研究表明，HPV感染也是VAIN的致病因素。虽然发现下生殖道病变均与HPV感染有关，但与HPV感染有密切关系的VAIN仍罕见。本文回顾性研究了226例阴道病变患者的临床资料，着重分析了HPV的分布，探讨HPV检测应用于VAIN及阴道鳞癌中的临床价值。


1资料与方法  

 

　　1.1    临床资料    选择中国医科大学附属盛京医院2008年1月至2012年12月门诊或病房VAIN及阴道鳞癌患者共226例。入选条件：患者均非妊娠状态，无急性生殖道炎症，无盆腔放射性治疗史，检查前 3 d没有阴道用药及性生活。年龄20～77（45.55±11.41）（95%CI 44.05～47.05）岁；平均孕次2.4次（0～7）；平均产次1.2次（0～4）次。全部患者签署知情同意书后行相关手术，经组织病理学检查证实后分为4组：（1） VAINⅠ级94例（41.59％）。（2）Ⅱ级74例（32.74％）。（3）Ⅲ级28例（12.40％）。（4）阴道鳞癌30例（13.27%）。根据患者临床表现、HPV DNA及液基薄层细胞检测（TCT）等结果，必要时辅助电子阴道镜检查，权衡患者年龄等基本情况，以及病变级别、病灶位置及大小等病理情况，行观察或择期手术，针对阴道病变术式包括阴道壁活检术、阴道壁病灶环形电极切除术（LEEP）、阴道壁病灶冷刀切除术、部分或全部阴道切除术、阴道癌根治术等相关手术。

　　1.2    采样    具体采样方法：受检者取膀胱截石位，有经验的妇产科医生置窥器暴露宫颈后，棉签擦去宫颈口过多分泌物，将专用宫颈细胞采集刷伸入宫颈管内，按顺／逆时针方向旋转３～５圈，抽出宫颈刷，迅速将收集的细胞保存在专用的固定液样本中。采样在非月经期进行，采样前1 d禁性生活，采样前３ d不用阴道栓剂。

　　1.3    HPV-DNA分型检测    226例患者均进行了HPV DNA检测，应用凯普核酸分子快速杂交仪，均采用第二代杂交捕获法（HC-II），通过导流杂交基因芯片技术检测，使扩增后的病毒 DNA 分子导流穿过已经固定好寡核苷酸探针的低密度基因芯片膜进行快速杂交，一次性检测21种HPV（6，11，16，18，31，33，35，39，42，43，44，45，51，52，53，56，58，59，66，68 ，CP8304）。实验步骤如下：（1）样本DNA分离提取：抽提病毒基因组DNA，方法按试剂盒说明进行。（2）聚合酶链反应（PCR）扩增：样本作为模板，反应体系25μL，其中提取的DNA模板5μL。反应条件为95℃ 9 min，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s扩增40个循环，72℃ 延伸5min。（3）导流杂交（Flow-throughhybridization）：杂交仪及杂交液45℃预热，在杂交平台上置入标记的有21种HPV基因型寡核苷酸探针的低密度基因芯片；将扩增产物于95℃变性5 min，冰浴2 min，加入检测孔内进行10 min的导流杂交；加入封阻液封闭为反应的空白微孔，酶标显色。（4）结果判断：肉眼观察检测结果，在膜条上蓝紫色圆点显现的位置即为HPV的亚型，多个圆点阳性即为多重感染。每张芯片上有PCR反应质控点和杂交显色质控点各一个。

　　1.4    统计学方法    所有资料使用SPSS 18．0分析，计数资料比较用χ２检验，不同阴道病变分组HPV 阳性率的比较采用χ２检验，组间计量资料采用ｔ检验，各基因型阳性率重复计算 3 次，所有数据检验均为双侧。P＜0.05为差异有统计学意义。


2结果 

 

　　2.1    阴道病变患者的年龄分析    226例患者年龄20～77（45.55±11.41）（95%CI：44.05～47.05）岁；196例VAIN患者年龄20～77（44.26±10.65）（95%CI：42.75～45.75）岁；30例阴道鳞癌患者年龄27～74（54.03±12.75） （95%CI：49.27～58.79）岁。阴道鳞癌与VAIN的整体年龄分布明显不同，差异有统计学意义（t=-4.559，P<0.01）。< span="">

2.2  不同型别HPV感染率  226例患者均行HPV DNA分型检查，其中HPV阴性45例，阳性181例，阳性率为80.09%（181/226），有17种HPV DNA分型被检出。16型感染比例最高，占31.42%（71/226），其次为58型占14.60%（33/226），33型占10.62%（24/226），CP8304型占9.73%（22/226）及53型占7.52%（17/226）。 

　　2.3    不同型别HPV在单重及多重感染中的分布    HPV单重感染共120例，占所有HPV感染患者的66.30%（120/181），其中低危型占11.67%（14/120），高危型占88.33%（106/120）。多重感染占33.70%（61/181），其中双重感染占25.97%（47/181），三重感染占5.52%（10/181），四重感染占2.21%（4/181）。低危型主要引起多重感染为主，高危型以单重感染为主，且差异有统计学意义（χ２=10.833，P＜0.01）。

        在不同级别病变中均存在HPV的单重及多重感染，单重感染所占比例随病变级别的升高呈增高趋势，但多重感染所占比例并未随病变级别升高而增高。

　　2.4    HPV感染与年龄的关系    各个年龄段患者均可发生HPV感染，随着年龄的增高，HPV感染在病变患者中的阳性率有逐渐升高的趋势，20～29岁年龄组感染率相对较低，在40～49岁年龄组达高峰，但50～59年龄组趋于下降，60～69岁年龄组再次升高，70以上年龄组病变患者中HPV的感染率为100%。

　　2.5    阴道病变与hr-HPV感染关系    181例行HPV检查阳性患者中，hr-HPV感染阳性率为90.06％（163/181）。随着VAIN级别升高，HPV及hr-HPV检出率均逐渐升高。在VAINⅢ及阴道鳞癌中，检出的HPV均为高危型。各级别病变行HPV DNA检测及其结果。

　　2.6    各亚型在不同级别病变中的分布    在VAINⅠ组检测出16种基因型，主要感染基因型依次为16型（19.15％，18/94）、58型（13.83％，13/94）、CP8304型（13.83％，13/94）、68型（9.57％，9/94）；在VAINⅡ组检测出16种基因型，主要感染基因型依次为16型（31.08％，23/74）、33型（14.86％，11/74）、53型（12.16％，9/74）、58型（10.81％，8/74）；在VAINⅢ组检测出8种基因型，主要感染基因型依次为16型（53.57％，15/28）、58型（21.43％，6/28）、33型（10.71％，3/28）；在阴道鳞癌组检测出10种基因型，主要感染基因型依次为16型（50.00％，15/30）、58型（20.00％，6/30）、18型（6.67％，2/30）。16型感染在所有级别病例组中均居首位，并在阴道鳞癌组、VAINⅢ组的发生率显著高于VAINⅠ组和VAINⅡ组（χ２：17.756，P＜0.01）；低危型别6型及11型以多重感染形式也出现在阴道鳞癌组、VAINⅢ组。


3讨论  

 

　　HPV在生殖道上皮内瘤变的发病中具有重要作用，但主要集中在CIN的研究中。VAIN也与HPV感染密切相关，但研究相对较少。在亚太地区及全球范围内，阴道癌的发病率均非常低。对于VAIN及阴道鳞癌的患病率及引起疾病的HPV分布，可供分析的数据有限。

　　Li等的研究表明，HPV感染是VAIN发病的危险因素。Logani等只研究了因HPV阳性确诊的VAIN病例（n=18），导致HPV的阳性率为100％。另外两个研究（n=74，111）报道了类似的HPV阳性率，分别是82.4％和83％。Smith等发现HPV阳性率在VAINⅠ中为98.5％，在VAINⅡ和Ⅲ中为92.6％。De Vuyst等报道在VAINⅠ中HPV阳性率为100％，在VAINⅡ和Ⅲ中为90.1％。本研究中的HPV感染阳性率为80.09%（181/226），hr-HPV在HPV感染患者中的阳性率为90.06％（163/181）；并且，随着VAIN级别增高，HPV感染阳性率增高：VAINⅠ级中为75.53%，Ⅱ级中为81.08%，Ⅲ级中为89.29%，阴道鳞癌中为83.33%，这与De Vuyst的meta分析中的结果一致。

　　VAIN及阴道鳞癌中主要感染的HPV基因型存在地理差异。在欧美地区，Smith等发现，HPV16型在阴道癌的阳性率是55.4％，在VAINⅡ和Ⅲ中的阳性率是65.8％。在Sugase等的荟萃分析中，16型同样占主导地位（23.4％），但也检测到了其他的HPV型别，如在VAINⅠ中56型阳性率为11.0％，51型阳性率为（8.8％）；在VAINⅡ和Ⅲ中，最常见的HPV类型仍为16型（57.6％），其次为18型（6.9％）和58型（5.9％）。HPV58在欧洲和北美居第五位，在非洲居第六位。Insinga等报道在美国，18型在VAINⅠ中的阳性率为19.4％，在VAINⅡ和Ⅲ中阳性率为16.3％。在亚太地区，Chao等报道台湾地区阴道病变患者主要感染HPV型别依次为16型（35.5%）， 58型（9.9%）， 52型（9.9%）， 39型（8.4%）， 33型（7.3%） 及53型（7.0%） 。本研究中，病例均来源于辽宁省内，HPV型别检出率居前5位的依次是16型（39.23%，71/181），58型（18.23%，33/181），33型（13.26%，24/181），CP8304型（12.16%，22/181）及53型（9.39%，17/181）。对于引起宫颈病变的主要亚型的18型，在阴道病变中的感染率较低（6.08%），这与一项日本的研究一致，他们的结果表明71例VAINⅠ样本中只有1例是HPV18型阳性（1.4％）。这说明阴道病变主要感染基因型存在着共性及地理差异，不同的研究结果均表明，HPV16型依然在女性下生殖道感染中占有重要地位，其余型别的分布情况随地区差异而不同，在我国18型较为少见。

　　HPV16型感染也是阴道病变的最大威胁。在本研究中主要体现在以下2个方面：（1）在不同病理级别分组中，HPV16型感染率均居首位，并且显著高于其他各型感染；另一方面，阴道癌病例组中，HPV16型作为独立感染原的病例占36．67％（11/30），同时有16型参与的多重感染另占13．33％（4/30），也就是近半数患者的阴道癌与HPV 16型有关。进一步说明HPV16型感染是阴道病变的一大威胁，对其进行研究将是揭示阴道癌甚至是女性下生殖道恶性肿瘤发生机制的一个重要突破口。

　　值得注意的是，某些低危亚型在阴道病变标本中所占比例也较高，甚至高于某些高危亚型，例如CP3804；同时，伴随高危基因型的低危型别存在，它们在阴道病变发生、诊断和治疗方面的影响也需要进一步关注。

　　多重感染对阴道上皮内瘤变及阴道癌的发生率是否有影响尚不确定。HPV的多重感染是否会促进宫颈癌的发生目前还存在争议，多重感染对阴道癌的发生是否有促进作用尚未有讨论。我们的分型检测结果认为多重感染并不增加阴道癌的发生率。

　　对高危基因型别需要进一步认识。从本研究结果看，作为独立感染原（单重感染）出现在阴道癌组织中的仅是高危基因型中有限的基因型（如16、33、58、18型），大多数基因型未单独出现在阴道癌组中。可以由此推测，虽然阴道癌的发生是多种因素综合作用的结果，但具体基因型别的作用仍可能非常关键；同时，尽管流行病学提示阴道癌组织并存有多种高危基因型，但这些高危基因型在阴道上皮内瘤变发生中的作用仍需进一步的基础研究证实。

　　我们的研究仍存在这很多局限。首先，对患者的阴道细胞样本的检测未形成前后连贯的系列分析，导致未能将这些阴道病变患者的HPV感染型别是否出现过自然消退或其他型别再感的情况进行对比。其次，阴道病变患者常合并其他妇科恶性肿瘤，而这些合并其他肿瘤的患者常进行如放化疗手术等辅助治疗。同时，在组织学上正常阴道的HPV感染状态的数据比较缺乏。这些HPV型别是否在初次手术时就已出现，或者在暴露后是否经历了一个较长的潜伏期，或者放化疗后是否进展均未知。

　　从预防的角度看，HPV是CIN和VAIN的原因，我们希望HPV疫苗可广泛用于降低CIN和VAIN的发生上。现在很多国家进行了大样本量群体接种多价HPV疫苗，并确认其有效性和安全性。我们在较大样本中了解了阴道上皮内瘤变及阴道癌中HPV基因型别的分布情况，这是流行病学调查的需要，对阴道病变的预后判断、治疗方案选择及效果监测、HPV型别特异性疫苗的研制等方面也都具有重要价值。