NK细胞与不明原因早期自然流产的临床研究

　　临床上自然流产的发生率为10％～20％，除了已知的母体内分泌失调、子宫病变、遗传性疾病或其他全身性疾病等主要致病因素外，仍有约50％患者病因不明^[1] 。免疫学研究认为，妊娠是一种同种移植现象，流产是移植排斥的结果，在正常妊娠过程中，胚胎作为一种半同种体组织抗原却不受母体排斥而存活，这与蜕膜组织中正常的免疫微环境有着一定的关系，尤其是孕12周以内，胎盘与母体的紧密联系还未完全建立时，蜕膜微环境对胚胎的生长尤为重要^[2] 。近年母体胎盘界面上NK细胞引人注目，NK细胞可通过对靶细胞的识别，并分泌细胞因子，发挥对妊娠的免疫调节作用，并认为一旦调节作用失衡就可导致自然流产等不良后果^[3] 。本文采用流式细胞仪与免疫荧光技术相结合的方法对不明原因早期自然流产患者及正常孕妇早期外周静脉血及蜕膜组织中NK细胞进行检测，以探讨NK细胞与不明原因早期流产的关系，进行分析，结果如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象 选择2005年7月至2006年11月来兰州市第二人民医院和兰州大学第一医院就诊的妊娠妇女。所选病例均未使用任何激素类药物，无异常孕育史，无内分泌疾病史，行血常规、乙肝三系统及Torch抗体检测排除感染，B超检查排除子宫病变和宫内节育器，宫颈黏液涂片行巴氏分级I级。早孕组33例，外周静脉血及蜕膜组织取自健康妊娠12周内、门诊要求人工流产妇女；病例组3l例，外周静脉血及蜕膜组织取自排除上述各种临床致病因素的门诊及住院早期自然流产患者(先兆流产者阴道流血超过2小时者除外)。两组年龄在22～31岁。

1.2　方法　无菌留取研究对象肝素抗凝静脉血2ml。血标本制备取两支试管各加入肝素抗凝血100μl，分别加入各荧光标记抗体20μl混匀，放置15分钟，放入Coulter-Q-Prep处理机后，采用直接荧光方法通过流式细胞仪检测。早孕组蜕膜标本来自妇女人工流产手术后，识别出绒毛，留取蜕膜组织；病例组于清宫后，留取蜕膜组织。组织块标本的制备取新鲜组织，用眼科剪刀剪碎，在300目筛网上过滤制成单细胞悬液，用PBS(pH=7.2)洗1次，离心1000转5分钟，弃上清液制成浓度为5x10⁵／ml~5×l0⁶／ml单细胞悬液。取两支试管各加入细胞悬液l00，充分混匀后，室温暗处静置15分钟，用Coulter-Q-Prep处理机上机待测。用FLOW CHECK标准FCM的光路和液路，确定其cV值小于2％，用FTTC-IgG1／PE-IgGl阴性对照管设立荧光染色分界线，然后进行检测，FCM配套软件IMMUNO TEST取数和分析。{NextPage}

1.3　统计学处理　采用SPSS10.0版本统计软件对数据进行两样本的两个总体均数差别的t检验，P<0.05，差异有统计学意义。

2　结果

2.1　病例组外周静脉血NK细胞百分含量和早孕组外周静脉血NK细胞百分含量相比，病例组含量明显减少，差异有高度统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2　病例组蜕膜中NK细胞百分含量和早孕组蜕膜中NK细胞百分含量相比，病例组含量明显减少，差异有高度统计学意
义(P<0.01)。见表1。

2.3　病例组外周静脉血NK细胞百分含量与蜕膜中NK细胞百分含量，经统计学处理，其直线相关系数r=0.278，总体相关系数假设检验，P>0.05，两者在数值上不存在直线相关，无显著相关性。

3　讨论

　　本文测得不明原因早期自然流产患者与正常妊娠早期妇女相比，外周静脉咀及蜕膜组织中NK细胞含量减低，差异有高度统计学意义，说明NK细胞在不明原因早期自然流产中起到了关键的作用。其亚群中CDI6⁺细胞数上升，发挥抗体依赖的细胞介导的细胞毒(ADCC)作用，导致流产。其机制是CD16⁺亚群细胞表面FcrⅢ发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用.即ADCC效应，启动NK细胞的杀伤功能，释放穿孔素及丝氨酸酯酶，导致组织损伤，引发流产^[4] 。另外CD56⁺NK细胞减少，可能减少了细胞因子的表达，故不能提供胎儿适当生长环境而导致流产。实验过程中测得不明原因早期流产患者外周静脉血与NK细胞均减少，但经统计学处理其直线相关系数r=0.278，总体相关系数假设检验P>0.05，两者在数值上不存在直线相关，无显著相关性，互相不能代替，具体分析个体情况还需与临床病情变化结合。{NextPage}

　　常规人工技术检测的淋巴细胞群仅占总数的很小一部分，最多200个，速度极慢，误差大；而流式细胞仪1次检测5000个细胞，且速度极快、误差小、客观性强，其标本制备及检测都在同一管中完成，大大减少了常规方法可能引起的污染环节。本文NK细胞表型是根据当前细胞表型在研究中应用的普遍性和对临床的指导意义确定的，目前临床上将CD3^- 、CD56⁺ 、CDI6^-淋巴样认定为NK细胞^[5] ，故本文检测NK细胞利用两种在NK细胞表面表达80％以上的CD56、CD16联合标记。CD56抗原存在于T细胞上，但成熟NK细胞不表达CD3，用双色标记除去T细胞中表达部分，CDI6抗原也存在于中性粒细胞和嗜碱性粒细胞上，但在流式细胞仪检测时通过FSC(前向散射角)和SSC(侧向散射角)对细胞大小颗粒度的检测。已先区分出淋巴细胞。进一步通过抗体标记，检测出CD56⁺ 、CD16^-细胞，结果准确，具有重要的I临床指导意义。

参考文献

［1］ 张鲁榕 孔宪涛 张浩 等.流式细胞分析仪100例正常人T细胞亚群[J].上海免疫学杂志,1998,8(5):464. 
［2］ 林其德 沈敏.正常孕妇及妊高征患者T淋巴细胞亚群及T抑制细胞功能的变化[J].中华妇产科杂志,:. 
［3］ Ho HN.Chao KH.Chen CK.et al.Activation status of T and Nk cell in the endometrium throughout menstrual