Abstract

Aim To evaluate the preventive and therapeutic effects ofLactobacillus casei Zhang on impaired glucose tolerance(IGT) by using fructoseinduced hyperinsulinemia rats.Methods Rats were fed 25 % fructose solution forhyperinsulinemia with L. casei Zhang for prevention ortherapy. Serum levels of insulin, glucagon-like peptide-2(GLP-2), osteocalcin, malondialdehyde (MDA), totalintestinal bile acids and hepatic glycogen contents weredetermined by assay kits. The major bacteria from fecesand liver expression of adiponectin receptor 2 (AdipoR2),liver X receptor-a (LXR-a),peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma (PPAR-c) and vitamin K epoxidereductase complex subunit 1 mRNA were assessed by RTPCR.Pancreas injury was evaluated by histologicalanalysis.

Electronic supplementary material The online version of this

article (doi:10.1007/s00394-013-0519-5) contains supplementary

material, which is available to authorized users.

Present Address:
Y. Zhang  L. Wang  J. Zhang  H. Li  X. Guo  J. Guo H. Zhang (&)

Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Education Ministry of P. R. China, Department of Food Scienceand Engineering, Inner Mongolia Agricultural University, 306Zhaowudalu Road, Hohhot 010018, People’s Republic of Chinae-mail: hepingdd@vip.sina.com

Y. Li

Department of Biological Science and Engineering,Inner Mongolia Agricultural University, Hohhot,

People’s Republic of China

Q. He

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Schoolof Food Science and Technology, Jiangnan University, 1800Lihu Road, Wuxi 214122, People’s Republic of China

IGT Impaired glucose toleranceIR Insulin resistanceLXR-a Liver X receptor-a

MDA MalondialdehydeOGTT Oral glucose tolerance testPPAR-c Peroxisomeproliferator-activatedreceptor gamma

SD Sprague DawleyVKORC1 Vitamin K epoxide reductase complexsubunit 1

Introduction

High fructose syrup (HFS) has become a widely consumedingredient in the past decades. HFS-sweetened soft drinkswere largely consumed and were partly responsible forincreased energy intake and body weight with an increasedrisk of various metabolic disorders [1]. Especially, HFSsweetenedbeverage consumers mainly consisted of adolescentsand young adults will provide profound adverseinfluence on public health [2].

Animal and human experiments show that high fructoseintake is clearly associated with insulin resistance (IR),cardiovascular disease, hypertension, kidney disease andtype 2 diabetes [3, 4]. It is well recognized that insulinresistance with impaired glucose tolerance (IGT) is a majorrisk factor for these diseases [5].

There are various public interests in the developmentof probiotic treatments to modify the intestinal flora,improve immunity and alleviate inflammation. In addition,several studies have shown an anti-diabetic effectof lactic acid bacteria. A series of research by Yadavet al. [6–8] showed that L. casei, or combined L.acidophilusand L. casei fermented milk (called Dahiyoghurt), could exert beneficial effects on glucoseintolerance in high-fructose-induced hyperinsulinemia orstreptozotocin-induced diabetes. Similarly, probioticLactobacillus GG and LcS had been reported to improveglucose intolerance in diabetic rodents [9, 10]. In addition,Lactobacillus gasseri BNR17 and Lactobacillusplantarum DSM 15313 also showed a blood glucoseloweringeffect [11, 12].

    Lactobacillus casei Zhang, a koumiss-derived probioticlactic acid bacterium, has been demonstrated to improvegut health, reduce blood lipids and improve immune

function [13, 14]. The objective of this study was toevaluate the preventive andtherapeutic effect of L. caseiZhang on IGT and related factors in high-fructose-fedrats.

Materials and methods

     All protocols were approved by Animal Care and UseCommittee at Inner Mongolia Agricultural University.Male Sprague Dawley (SD) rats with body weight rangefrom 170-190 g (8 weeks old) were purchased from VitalRiver Laboratory Animal Co. Ltd. (Beijing, China) andkept in animal room with constant temperature

(22 ± 2 C) and humidity (55 ± 5 %) in 12-h light anddark cycles. All animals received a normal chow dietad libitum containing 50 % corn and wheat starch, 25 %wheat bran, 20 % soybean pieces, 2 % bone powder, 2 %fish powder, 0.9 % table salt and 0.1 % vitamin mixture.Body weight of rats were measured twice a week.

Experimental design

  The treatment protocol listed in Fig. 1. Following 1-week\acclimatization period, rats were randomly divided into thefollowing five groups (n = 10 for each group): normalcontrol group (NC), L. casei Zhang-preventive group (LP),hyperinsulinemia model group 9-week (HMI), L. caseiZhang-therapeutic group (LT) and hyperinsulinemia modelgroup 13-week (HMII). Animals within the different groups

were placed in different cages. Plastic cages with wire-meshfloors were used for coprophagy prevention. Hyperinsulinemicrats were induced by feeding 25 % fructose water for9 weeks, and subsequently, serum insulin levels weredetermined for model establishment. Fructose water intakein LP, HMI, LT and HMII started from the 2nd week to theend of being killed. L. casei Zhang was administrated (109cfu/drat, other control groups with physiological saline) inLP from 2nd week to 10th week and in LT from 10th week to14th week. Rats of LP and HMI group were killed andsampled at 10th week, while NC, LT and HMII group ratswere killed at 14th week. Oral glucose tolerance test (OGTT)was performed in NC, LP and HMI groups before the firstkilled time and in NC, LT and HMII groups before the second

killed time. Except insulin and OGTT measurements, otherbiomarkers were determined from killed samples.

The SD rats were fasted overnight and killed by bleedingfrom the femoral artery under anesthesia. Serum wereobtained by centrifuging blood at 3,000 g for 15 min andstored at -80 C until being thawed for analyses. Bloodglucose level was measured by AN WEN Blood GlucoseMonitor (San Nuo Biosensing Technology Company,

Changsha, China). For OGTT, rats were fasted for 12 h,followed by an oral glucose load (2 g/kg of body weight).Blood glucose levels from the tail vein of the rats were

measured at 0, 15, 30, 60 and 120 min following glucoseadministration. Insulin levels were measured by RIA kits(RIA; Northern Biotechnology Research Institute, Beijing,China). Osteocalcin and glucagon-like peptide-2 (GLP-2)were measured with ELISA (Millipore or Alpco). MDAlevels were determined with commercial kits (Nanjing JianchengBiotechnology Institute, China).

Measurement of intestinal bile acids

Mucus from small intestine was collected, and tenfolddilution of cell-free supernatants was obtained throughcentrifuge (3,000 g, 5 min) and bacteria proof filter(0.22 lm). Total bile acids levels were determined byELISA (R and D Systems, USA) according to the manufacturer’sprotocol.

Liver glycogen content

Liver glycogen contents were measured using a glycogencommercial kit (Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute,Nanjing, China). Approximately 100 mg of liver tissuewas placed in a boiling NaOH (10 N, 300 ll) bath for20 min and cooled with running tap water. After digestionof tissue, 9.6 ml of distilled water was added to prepare1 % liver glycogen solution for the next detection. 100 llof 1 % preparing solution was mixed with 0.9 ml of distilledwater and reacted with 2 ml of anthrone coloirmetry(dissolved in 98 % concentrated sulfuric acid) in boilingwater for 5 min. After a quick cooling, the OD was readwithin 2 h at 650 nm.

Composition of intestinal predominate bacteria

Fecal total RNA was extracted from the feces of animalswith FastRNA Pro Blue Kit (MP Biomedicals, Solon,USA). Specific primers of Lactobacillus, Bifidobacterium,

B. fragilis and Clostridium were listed in SupplementalTable 1. The reaction mixture (20 ll) contained 10 mMTris–HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 200 lM

of each dNTP, 500 lg/ml bovine serum albumin (Takara),a 1:75,000 dilution of SYBR Green I (Invitrogen), 0.4UTaq DNA polymerase Hot Start version (Takara), 0.2 lMof the specific primers and 2 ll of template DNA. Theamplification protocol consisted of 1 cycle of 94 C for20 s; 40 cycles of 94 C for 5 s, 56 C for Lactobacillus(62 C for Bifidobacterium, 58 C for B. fragilis and 60 Cfor Clostridium) for 35 s and 72 C for 50 s, and finally, 1cycle of 72 C for 180 s. Fluorescence intensities weredetected during the last step of each cycle. The quantity ofeach bacterial groups was calculated according to thestandard curve. The bacterial strains used for standardcurves in this study included B. fragilis JCM 11019,

L. acidophilus NCFM, Bifidobaterium animalis Bb-12 andClostridium coccoides JCM 1395T.

RT-PCR of AdipoR2, LXR-a, PPAR-c and VKORC1mRNA

To assess adiponectin receptor 2 (AdipoR2), liver Xreceptor-a (LXR-a), peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma (PPAR-c) and vitamin K epoxide reductase

complex subunit 1 (VKORC1) mRNA expression,total RNA was isolated from rat liver by using the Fast-RNA Pro Green Kit on a FastPrep-24 sample preparationsystem (MP Biomedicals, CA, USA) at a setting of6.0 m/s for 40 s. To obtain cDNA, 500 ng of RNA waspurified and reversely transcribed with PrimeScript RTreagent kit (Takara, Japan). RT-PCR was performed on anApplied Biosystems StepOneTM RT-PCR System withabove-described reagents according to the manufacturer’sinstructions. 18S or GAPDH was used as endogenouscontrol to normalize the expression level of gene. Primersequences for AdipoR2, LXR-a, PPAR-c and VKORC1were listed in Supplemental Table 2. All reactions weredone in a 20-ll reaction volume. A melt curve analysis wasperformed to verify the specificity of the amplification. Theresults are expressed as a relative value after normalizationto 18S or GAPDH mRNA.

Histological evaluation of pancreas

Pancreas tissues of rats were fixed in 10 % neutral formalin,followed by dehydration in gradient alcohol (75, 85,95 and 100 %) and xylene (100 %). The tissues were thenembedded in paraffin and sectioned at 5 lm thickness.Sectioned tissues were stained with hematoxyl-in-eosin formicroscopic assessment (Olympus, Tokyo, Japan).

Statistical analysis

Results are expressed as Mean ± SEM. Data were analyzedwith one-way analysis of variance test (ANOVA)using SPSS statistical software (version 13.0, Chicago,

USA). Comparisons among groups were performed withFisher’s least significant difference (LSD) test. P\0.05was considered statistically significant for multiple comparisonsamong 3 or 5 groups. Correlation between B. fragilisand osteocalcin level was performed using Pearson’scorrelation analysis.

Results

As shown in Fig. 2, high fructose intake (LP, HMI, LT andHMII) significantly increased body weight gain as comparedto NC group during the experimental period. However,the body weight in the LP group was significantly

Fig. 2 The body weight changes of rats during experimental period.Black up pointing triangle NC group; white circle LP group; whitediamond HMI group (9 weeks); black down pointing triangle LTgroup; black square HMII group (13 weeks). (*P\0.05 stand for the significance between LP group and HMI group)

lower from the 44th day until the end of the study comparedto the HMI group (Fig. 2, p\0.05).

Seen from Fig. 3a, high fructose intake significantlyelevated circulating insulin levels except LP group after9-week fructose feeding (p\0.05). In the end, the insulinlevel in HMII group was significantly higher than that inthe NC group (p\0.05), while no significant differenceswere observed between group LT and HMII (p[0.05).

High fructose intake could induce impaired glucosetolerance compared to NC group (Fig. 4a and b, p\0.01).Compared with the HMI group, LP group showed a loweringof serum glucose peak value at 60 min, but this wasnot statistically significant (Fig. 4a, p = 0.236), while theL. casei Zhang had a significant effect on lowering ofserum glucose peak value at 60 min compared to HMIIgroup (Fig. 4b, p = 0.048). When considering area undercurve (AUC), LP group prevented rats from an increasedglucose intolerance, while a significant increased oralglucose tolerance observed in HMI (Fig. 4c, p\0.05) andthe LT group showed significant improved oralglucosetolerance (Fig. 4d, p\0.05).

Liver glycogen content was markedly elevated by highfructose intake in HMII group compared to NC group(Fig. 3b, p\0.05). In the LP group, rats were preventedfrom a significant increased liver glycogen content comparedto HMI group (Fig. 3b, p\0.05). The lower liverglycogen level of LT compared to HMII group was alsostatistically significant (Fig. 3b, p\0.05).

The GLP-2 level was increased by fructose intake(HMII, Fig. 3c) in rats. By administration of L. caseiZhang, LP group showed a significant lowering comparedto HMI group (p\0.05), while LT group had no effects incomparison with HMII control (p[0.05, Fig. 3c).

Osteocalcin level was significantly higher in LT groupthan HMII group (Fig. 3d). In contrast, the osteocalcinlevel in LP group did not change significantly compared toHMI after L. casei Zhang administration. The mean ±SEM changes in serum osteocalcin concentrations for LPand LT groups receiving the L. casei Zhang supplementwere 823.3 ± 26.54 and 1,080.0 ± 35.0 nmol/l, respectively,whereas these levels in the two HM control groups(HMI and HMII) were 730.0 ± 10.10 and 561.7 ±16.58 nmol/l, respectively.

It showed in Fig. 3e that the serum MDA level wassignificantly lower for L. casei Zhang-treated LT groupthan for the HMII, with a mean value equal to 7.014 nmol/lfor this group, by comparison to 5.355 nmol/l on averagefor the HMII control. Mean MDA level was also lower inthe LP group compared to HMI, but this change did notreach a statistical significance (p[0.05).

Small intestinal total bile acids level (Fig. 3f) in L. caseiZhang-treated LT group showed a nearly significant elevationcompared to HMII (p = 0.060). No statistical

Fig. 3 Changes of IGT-associated biomarkers in all groups. a Serum    osteocalcin level in different groups. e Serum insulin levels of rats in all groups. b Liver glycogen content in different              MDA level in differentgroups. f  Smallintestinal groups. c Serum GLP-2 level in different groups. d Serum                        total bile acids level in different groups

 

 

Figure 5 showed that high fructose intake induced alow level of Bifidobacterium and a high level of Clostridiumas compared to those in HMI and HMII groups,the numbers of four groups bacteria in feces afteradministration of L. casei Zhang were significantly changed (p\0.01) except B. fragilis in LP group(Fig. 5c, p[0.05). Additionally, Pearson’s correlationanalysis revealed that four groups data of high fructoseintake showed B. fragilis number was positively correlatedwith osteocalcin level (r = 0.912, p = 0.031*), while fivegroups including NC controldata had no significant correlation(r = 0.807, p = 0.099).

Fig. 4 Changes of oral glucose tolerance and AUC. a Oral glucosetolerance of rats at 10th week. (black square) NC group; (black uppointing triangle) HMI group; (black circle) LP group. b Oral glucosetolerance of rats at 14th week. (black square) NC group; (blackdiamond) HMII group; (black circle) LT group. c AUC of OGTTamong NC, LP, HM groups after 9-week high-fructose fed. d AUC ofOGTT among NC, LT, HM groups after 13-week high-fructose fed

The relative liver AdipoR2 and LXR-a expression levelswere significantly different between LT and HMII, but nosignificance between LP and HMI (Fig. 6a and b). Thechanging tendency of relative liver PPAR-c mRNA levelwas similar to the change of osteocalcin level with significancebetween LT and HMII groups but not LP andHMI groups (Fig. 6c). There were no significant differencein relative VKORC1 mRNA expression among the groups(Fig. 6d).

Histological evaluation of pancreas was presented inFig. 7. The NC group showed few lobular gaps andround islets (a and e). Focal necrosis of acinar cells andloss of lobular architecture was observed in some rats inHMI and HMII groups (b and g). Gaps among lobules ofall high-fructose-fed rats were greatly widened (c, d, fand h). The area of islets was enlarged and irregularround in high-fructose-fed rats exceptLP group (b, g andh). Integral lobular architecture with no area of focalnecrosis was observed in LP and LT groups (c and d).Pancreas damage was looser in LP group than LT group(f vs. h).

Discussion

We designed this study to investigate whether administrationof L. casei Zhang could exert serum glucose-loweringeffect in a model of hyperinsulinemia by modifyingintestinal flora and regulating impaired glucose tolerancelinkedhealthy or risk factors. The present study found thatthere was no significantly increased AUC in oral glucoseintolerance in LP group and the LT group showed a significantreduction in both peak value and AUC in glucoseintolerance. It was suggested that L. casei Zhang could alsoameliorate impaired glucose tolerance.

Both preventive and ameliorative effects of L. caseiZhang on AUC were associated with hepatic glycogencontent. More than 70 % of dietary fructose is metabolizedby the liver, and high fructose burden induces a hepaticstress responsewith an increase in liver glucose uptake[15]. According to the results, L. casei Zhang administrationcould significantly reduce hepatic glycogen storageboth in LP and LT groups. This is in agreement with studywhere a probiotic dahi yoghurt-supplemented diet reducedthe accumulation of liver glycogen in the high-fructose-fedrat [6]. Thus, L. casei Zhang plays a regulator role inmaintainingglucose homeostasis of liver through reducing glucose output.

Area under curve preventive and ameliorative effect wasalso closely linked with oxidative stress and pancreasdamage. Islet beta cell mass expansion was considered aresponse to increased insulin demand due to obesity [16].In our study, more wide gaps around islets were connectedwith increased insulin levels and the area of islets in LPgroup was not enlarged which was consistent with lowinsulin level and no significant difference of AUC. Thestructural integrity of pancreas lobules was maintainedafter L. casei Zhang administration though had no effect onenlarging gaps among lobules. Pancreas injury may becaused by oxidative stress which was also reported byYadav et al. [6] in high-fructose-fed rats. MDA, a markerof oxidative stress accompanied by free radical-mediatedlipid peroxidation, is a mutagenic and carcinogenic threatto human health [17]. The MDA returned to a healthy levelafter L. casei Zhang administration both in LP and LTgroups in accordance with our previous investigation whereL. casei Zhang exhibited a favorable antioxidant capacity in hyperlipidemia rats [18].

    Accordingly, preventive and ameliorative effect of L. casei Zhang on AUC was accompanied by a high level of potentially beneficial bacteria including Lactobacillus

and Bifidobacterium as well as a low level of Clostridiumwere found in high-fructose-fed rats. Furthermore, a dropin B. fragilis numbers of high-fructose-fed rats was consistentwith previous researches which were showed areduction in Bacteroides in high fat fed rats [19].

   However, both of the preventative and therapeuticeffects by L. casei Zhang may be via different mechanisms.Probiotic L. casei Zhang showed a body weight and GLP-2reducing effect in the LP group but had no influence on LTgroup. It seemed that GLP-2 levels and body weight consistentwith insulin levels played a key role in the preventativeeffect. GLP-2 is an important nutrient-dependen tintestinally derived hormone affected by carbohydrate andfat intake and closely related to intestinal apoB48 production[20–22]. Significantly low levels of body weight in LP group indicated a low absorption to fructose and fatconversion. Moreover, Federico et al. [23] found that intestinal apoB48 secretion can be acutely inhibited by

insulin. Considering all these, the preventative effect may be explained by L. casei Zhang can reduce the absorption of fructose in the intestine through a lowering level of GLP-2 as well as probably lowering apoB48 secretion.

In therapeutic effect, L. casei Zhang intake brought about a series of differences. Firstly and directly, L. Casei Zhang-treated group maintained the high numbers of

Fig. 6 Liver gene expression in different groups. a Liver relativeadipoR2 expression level in different groups. b Liver relative LXR-aexpression level in different groups. c Liver relative PPAR-cexpression level in different groups. d Liver relative VKORC1 expression in different groups

    B. fragilis. Interestingly, the change of fecal numbers of B. fragilis was coincident with the OGTT peak glucoseconcentration of IGT rats. This result was supported by

Larsen et al. [24] clinical study that plasma glucose concentration of type 2 diabetes is closely related to relatively less Bacteroidetes.

    More importantly, we found that osteocalcin levels weresignificantly improved in LT group but not LP group,which was comply with the significantly decreased peakvalue of glucose tolerance only in LT group. It has beenreported that osteocalcin showed a positive effect onimproving glucose tolerance [25] and reduced osteocalcin

levels were observed in obese subjects and diabetic patients[26]. In addition, after administration of the inulin-richmilk fermented by Lactobacillus GG and Bifidobacteriumlactis for aged rats, osteocalcin levels were increased [27].

From these results, we hypothesed that L. casei Zhang may play a role in improvement of oral glucose tolerance of hyperinsulinemia rats via upregulation of osteocalcin.However, the non-significantly increased osteocalcin level in LP group may be explained by that osteocalcin is  reduced by long term of obesity andprobably associated with changes of microflora especially the B. Fragilis.

    Bacteroides fragilis number was positively correlatedwith osteocalcin level in all high-fructose-fed rats excepthealthy control rats. This may be explained by a high interindividualvariability in NC group. To seek the relationshipbetween osteocalcin and B. fragilis, we focus on vitamin K2production from two main aspects. On the one hand, osteocalcinis a vitamin K-dependent protein [28]. On the otherhand, B. fragilis is one of two main species (B. fragilis andBacteroides vulgutus) producing vitamin K2 in microbiota[29]. Furthermore, vitamin K including vitamin K1 and

vitamin K2 (also known as phylloquinone and menaquinones)has been proved to play an beneficial role in humans with IR and type 2 diabetes via osteocalcin [30, 31].

Fig. 7 Representativephotomicrographs of pancreatafrom rats. a and e NC group,×50 and ×200 b and g HMI andHMII group,×50 and 9200.c and f LP group,×50 and×200. D and h LT group, ×50 and ×200

    VKORC1 (a gene for recycling reduced vitamin K) expressionwas not altered in all groups, suggesting that administrationof L. casei Zhang had no effects on the vitamin Kcycle and made no contribution to endogenous production of vitamin K in rats. Although vitamin K2 was not determined in the present study, both significant upregulation of ostocalcin level and higher numbers of B. fragilis by L. Casei Zhang could indirectly indicate the vitamin K2 role in highfructose- fed post-adolescent rats. Besides, nearly high level of bile acids in small intestine induced by L. casei Zhang may partly contribute to facilitating the absorption of vitamin K2 according to Olson et al. [32].

    Recently, adiponectin has proved to mediate the role ofosteocalcin in the regulation of oral glucose tolerance inhuman [33]. Serve as one of the predominant receptors foradiponectin, AdipoR2 is associated with obesity-associatedinsulin resistance and type 2 diabetes and plays importantroles in glucose and lipid metabolism, inflammation andoxidative stress [34, 35]. Consistent with changes of osteocalcin,AdipoR2 mRNA expression was higher in liver of probiotic-treated rats than long-term (13 weeks) high-calorie intake rats (HMII group) and correlated positively with improved oral glucose tolerance, whereas a relative shortterm

(9 weeks) high-calorie intake had no influence. Similarly, adiponectin gene expression (Adipoq) was up-regulated in the groups of Lactobacilus-treated germ-free mice, and L. gasseri SBT2055 showed an adiponectinincreasing  effect in human [36, 37].

    The nuclear receptors LXR activation have been shownto improve glucose tolerance in IR murine model andselected as potential therapeutic targets for type 2 diabetes[38]. In our study, significant changes of liver LXR-a between LT and HMII associated with a improved glucose tolerance. Recent study had demonstrated probiotic could act as a LXR agonist to eliminate cholesterol in vitro [39].Moreover, L. casei Zhang had reported a cholesterolreducing effect with bile salt hydrolase activity to enhance the fecal bile acids elimination [14, 40]. Taken together, L. casei Zhang may exert activation on LXR-a through promoting bile acid excretion. This is consistent with view of Takebayashi et al. [41] on drugs of bile acid sequestrants which also showed glucose-lowering effect.

Closely associated with liver X receptor, PPAR-c is alsoa nuclear receptor which maintain expression of key glucoand liporegulatory molecules, and proteins involved in transduction of the insulin signal and thus influence insulinsensitivity [42, 43]. In this study, L. casei Zhang showed significant activation in LT group connected with osteocalcin. Previous studies have demonstrated that probiotics showed PPAR-c-activated properties in gastrointestinal inflammatory animal and high fat fed obese mice [44, 45]. The results indicated that L. casei Zhang can exertbeneficial effect on oral glucose tolerance in therapeutic group rats connected with PPAR-c and LXR-a activation.

Fig. 8 Possible mechanism involved in therapeutic effect of L. caseiZhang on high-fructose-fed post-adolescent rats

    Considering above logically, L. casei Zhang firstlychange the microflora characterized by increasing mainvitamin K2 producing specie B. fragilis and enhance thebile acids excretion in the intestine of high-fructose-fedpost-adolescent rats. Secondly, probably absorption ofmore vitamin K2 from intestine but not from production of engenous vitamin K cycle could induce the upregulation of osteocalcin in serum and bile acids acted as a LXR-a agonist in high-fructose-fed adult rats. Thirdly, PPAR-c is activated accompanied by LXR-a and osteocalcin level

influence the expression of Adipo R2. Finally, glucose tolerance of IGT post-adolescent rats is improved in therapeutic group (Fig. 8).

Conclusion

In summary, this study demonstrates that probiotic L. Casei Zhang can exert both preventive and ameliorative effect on oral glucose tolerance AUC in IGT rats. In preventive effect, L. casei Zhang reduce the absorption of fructose to maintain a low level of insulin likely to be through GLP-2 mechanism. In therapeutic effect, L. casei Zhang may improve oral glucose tolerance via a B. fragilis-mediated vitamin K2-dependent osteocalcin mechanism in highfructose- fed post-adolescent rats.

Acknowledgments We thank Dr. Dongmin Liu from Fralin Life Science Institute of Virgina Tech for revising this article. This research was supported by National Natural Science Foundation of China (Grant No. 31025019), the Innovation Team Development of the Ministry of Education of China (Grant No. IRT0967), National Basic Research Program of China (973 Program) (2012CB720802), Hi-Tech Research and Development Program of China (863 Planning, Grant No. 2011AA100901, 2011AA100902) and the Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System (Grant No. nycytx-0501).

 

Conflict of interest The authors declare that they have no conflict of interest.

References

1. Bray GA, Nielsen SJ, Popkin BM (2004) Consumption of highfructose corn syrup in beverages may play a role in the epidemic of obesity. Am J Clin Nutr 79:537–543

2. Moeller SM (2009) The effects of high fructose syrup. J Am Coll Nutr 28:619–626

3. Johnson RJ, Segal MS, Sautin Y, Nakagawa T, Feig DI, Kang DH, Gersch MS, Benner S, Sa´nchez-Lozada LG (2007) Potential role of sugar (fructose) in the epidemic of hypertension, obesity and the metabolic syndrome, diabetes, kidney disease, and cardiovascular disease. Am J Clin Nutr 86:899–906

4. Stanhope KL, Schwarz JM, Keim NL et al (2009) Consuming fructose-sweetened, not glucose-sweetened, beverages increases visceral adiposity and lipids and decreases insulin sensitivity in overweight/obese humans. J Clin Invest 119:1322–1334

5. Reaven GM (1995) Pathophysiology of insulin resistance in human disease. Physiol Rev 75:473–486

6. Yadav H, Jain S, Sinha PR (2007) Antidiabetic effect of probiotic dahi containing Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei in high fructose fed rats. Nutrition 23:62–68

7. Yadav H, Jain S, Sinha PR (2008) Oral administration of dahi containing probiotic Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei delayed the progression of streptozotocin-induced diabetes in rats. J Dairy Res 75:189–195

8. Yadav H, Jain S, Sinha PR (2008) The effect of probiotic dahi containing Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei on gastropathic consequences in diabetic rats. J Med Food 11:62–68

9. Tabuchi M, Ozaki M, Tamura A, Yamada N, Ishida T, Hosoda M, Hosono A (2003) Antidiabetic effect of Lactobacillus GG in streptozotocin-induced diabetic rats. Biosci Biotechnol Biochem

67:1421–1424

10. Naito E, Yoshida Y, Makino K, Kounoshi Y, Kunihiro S, Takahashi R, Matsuzaki T, Miyazaki K, Ishikawa F (2011) Beneficial effect of oral administration of Lactobacillus casei strain Shirota on insulin resistance in diet-induced obesity mice. J Appl Microbiol 110:650–657

11. Yun SI, Park HO, Kang JH (2009) Effect of Lactobacillus gasseri BNR17 on blood glucose levels and body weight in a mouse model of type 2 diabetes. J Appl Microbiol 107:1681–1686

12. Andersson U, Bra¨nning C, Ahrne´ S, Molin G, Alenfall J, O ¨ nning G, Nyman M, Holm C (2010) Probiotics lower plasma glucose in the high-fat fed C57BL/6 J mouse. Benef Microbes 1:189–196

13. Ya T, Zhang Q, Chu F, Merritt J, Bilige M, Sun T, Du R, Zhang H (2008) Immunological evaluation of Lactobacillus casei Zhang: a newly isolated strain fromkoumiss in Inner Mongolia,

China. BMC Immunol 19(9):68

14. Zhong Z, Zhang W, Du R, Meng H, Zhang H (2012) Effect of Lactobacillus casei Zhang on global gene expression in the liver of hypercholesterolemic rats. Eur J Lipid Sci Technol 114:244–252

15. McGuinness Owen P, Alan D (2003) Effects of fructose on hepatic glucose metabolism. Curr Opin Clin Nutr Metab Care 6:441–448

16. Greaves P (2007) Histopathology of preclinical toxicity studies, Third edition: interpretation and relevance in drug safety evaluation. Elsevier, USA, pp 533–534

17. Gil L, Siems W, Mazurek B, Gross J, Schroeder P, Voss P, Grune T (2006) Age-associated analysis of oxidative stress parameters in human plasma and erythrocytes. Free Radic Res 40:495–505

18. Zhang Y, Du R, Wang L, Zhang H (2010) The antioxidative effects of probiotic Lactobacillus casei Zhang on the hyperlipidemic rats. Eur Food Res Technol 231:151–158

19. Neyrinck AM, Possemiers S, Druart C, Van de Wiele T, De Backer F, Cani PD, Larondelle Y, Delzenne NM (2011) Prebiotic effects of wheat arabinoxylan related to the increase in bifidobacteria, roseburia and Bacteroides/Prevotella in diet-induced obese mice. PLoS ONE 6:e20944

20. Xiao Q, Boushey RP, Drucker DJ, Brubaker PL (1999) Secretion of the intestinotropic hormone glucagon-like peptide 2 is differentially regulated by nutrients in humans. Gastroenterology 117:99–105

21. Haidari M, Leung N, Mahbub F, Uffelman KD, Kohen-Avramoglu R, Lewis GF, Adeli K (2002) Fasting and postprandial overproduction of intestinally derived lipoproteins in an animal model of insulin resistance. Evidence that chronic fructose feeding in the hamster is accompanied by enhanced intestinal de novo lipogenesis and ApoB48-containing lipoprotein overproduction.

J Biol Chem 277:31646–31655

22. Hsieh J, Longuet C, Maida A, Bahrami J, Xu E, Baker CL, Brubaker PL, Drucker DJ, Adeli K (2009) Glucagon-like peptide- 2 increases intestinal lipid absorption and chylomicron production

via CD36. Gastroenterology 137:997–1005

23. Federico LM, Naples M, Taylor D et al (2006) Intestinal insulin resistance and aberrant production of apolipoprotein B48 lipoproteins in an animal model of insulin resistance and metabolic dyslipidemia: evidence for activation of protein tyrosine phosphatase- 1B, extracellular signal-related kinase, and sterol regulatory elementbinding protein-1c in the fructose-fed hamster intestine. Diabetes 55:1316–1326

24. Larsen N, Vogensen FK, van den Berg FW et al (2010) Gut microbiota in human adults with type 2 diabetes differs from nondiabetic adults. PLoS ONE 5:e9085

25. Lee NK, Sowa H, Hinoi E, Ferron M, Ahn JD, Confavreux C, Dacquin R, Mee PJ, McKee MD, Jung DY, Zhang Z, Kim JK, Mauvais-Jarvis F, Ducy P, Karsenty G (2007) Endocrine regulation

of energy metabolism by the skeleton. Cell 130:456–469

26. Fukumoto S, Martin TJ (2009) Bone as an endocrine organ. Trends Endocrinol Metab 20:230–236

27. Naughton V, McSorley E, Naughton PJ (2011) Changes in calcium status in aged rats fed Lactobacillus GG and Bifidobacterium lactis and oligofructose-enriched inulin. Appl Physiol Nutr

Metab 36:161–165

28. Choi HJ, Yu J, Choi H, An JH, Kim SW, Park KS, Jang HC, Kim SY, Shin CS (2011) Vitamin K2 supplementation improves insulin sensitivity via osteocalcin metabolism: a placebo-controlled

trial. Diabetes Care 34:e147

29. Mathers JC, Fernandez F, Hill MJ, McCarthy PT, Shearer MJ, Oxley A (1990) Dietary modification of potential vitamin K supply from enteric bacterial menaquinones in rats. Br J Nutr

63:639–652

30. Yoshida M, Jacques PF, Meigs JB, Saltzman E, Shea MK, Gundberg C, Dawson-Hughes B, Dallal G, Booth SL (2008) Effect of vitamin K supplementation on insulin resistance in older men and women. Diabetes Care 31:2092–2096

31. Beulens JW, van der A DL, Grobbee DE, Sluijs I, Spijkerman AM, van der Schouw YT (2010) Dietary phylloquinone and menaquinones intakes and risk of type 2 diabetes. Diabetes Care

33:1699–1705

32. Olson RE (1984) The function and metabolism of vitamin K. Ann Rev Nutr 4:281–337

33. Shea MK, Gundberg CM, Meigs JB, Dallal GE, Saltzman E, Yoshida M, Jacques PF, Booth SL (2009) Gamma-carboxylation of osteocalcin and insulin resistance in older men and women. Am J Clin Nutr 90:1230–1235

34. Yamauchi T, Nio Y, Maki T et al (2007) Targeted disruption of AdipoR1 and AdipoR2 causes abrogation of adiponectin binding and metabolic actions. Nat Med 13:332–339

35. Lo´pez-Bermejo A, Botas-Cervero P, Ortega-Delgado F, Delgado E, Garcı´a-Gil MM, Funahashi T, Ricart W, Ferna´ndez-Real JM (2008) Association of ADIPOR2 with liver function tests in type 2 diabetic subjects. Obesity 16:2308–2313

36. Nerstedt A, Nilsson EC, Ohlson K, Ha°kansson J, Thomas Svensson L, Lo¨wenadler B, Svensson UK, Mahlapuu M (2007) Administration of Lactobacillus evokes coordinated changes in the intestinal expression profile of genes regulating energy homeostasis and immune phenotype in mice. Br J Nutr 97: 1117–1127

37. Kadooka Y, Sato M, Imaizumi K, Ogawa A, Ikuyama K, Akai Y, Okano M, Kagoshima M, Tsuchida T (2010) Regulation of abdominal adiposity by probiotics (Lactobacillus gasseri SBT2055) in adults with obese tendencies in a randomized controlled trial. Eur J Clin Nutr 64:636–643

38. Laffitte BA, Chao LC, Li J, Walczak R, Hummasti S, Joseph SB, Castrillo A, Wilpitz DC, Mangelsdorf DJ, Collins JL, Saez E, Tontonoz P (2003) Activation of liver X receptor improves glucose tolerance through coordinate regulation of glucose metabolism in liver and adipose tissue. Proc Natl Acad Sci USA 100:5419–5424

39. Huang Y, Zheng Y (2010) The probiotic Lactobacillus acidophilus

reduces cholesterol absorption through the down-regulation

of Niemann-Pick C1-like 1 in Caco-2 cells. Br J Nutr

103:473–478

40. Zhang Y, Du R, He Q, Li H, Zhang H (2012) Beneficial effects of

Lactobacillus casei Zhang on liver lipids of diet-induced hypercholesterolemia

rats. Chin Agric Sci (in Chinese). doi:10.3864/j.issn.0578-1752.2012.05.015

41. Takebayashi K, Aso Y, Inukai T (2010) Role of bile acid sequestrants in the treatment of type 2 diabetes. World J Diabetes1:146–152

42. Olefsky JM, Saltiel AR (2000) PPAR gamma and the treatment of insulin resistance. Trends Endocrinol Metab 11:362–368

43. Hong C, Tontonoz P (2008) Coordination of inflammation and metabolism by PPAR and LXR nuclear receptors. Curr Opin Genet Dev 18:461–467

44. Kelly D, Campbell JI, King TP, Grant G, Jansson EA, Coutts AG et al (2004) Commensal anaerobic gut bacteria attenuate inflammation by regulating nuclear-cytoplasmic shuttling of PPAR-gamma and RelA. Nat Immunol 5:104–112

45. Zhao X, Higashikawa F, Noda M, Kawamura Y, Matoba Y, Kumagai T, Sugiyama M (2012) The obesity and fatty liver are reduced by plant-derived pediococcus pentosaceus LP28 in high fat diet-induced obese mice. PLoS One 7:e30696