肠道菌群肠道微生态系统是机体最大、最复杂的微生态系统，也是机体微生态系统中最主要和聂活跃的部分，动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物．微生物群的平衡，对机体的健康十分重要，肠遁菌群是肠道防御屏障的重要组戍部分，平衡的肠道菌群对人和动物的健康及长寿十分重夹．由于各种抗生素广泛长期的应用'一方面使耐药菌株增加，耐药因子迅速扩散，另一方面引起道菌群紊乱，造成肠道功能失调，乳酸菌活茵制剂能调整肠道微生态环境，重新建立起肠道正常茵群的平衡，保证机体正常的生理功能，达到防病，治病、保健，延年益寿的目的，本试验采用从内蒙古传统乳制品酸马奶中分离鉴定的具有较强的耐胆盐和耐酸特性的L，casei Zhang在小鼠肠道内的定植以及与致病菌的抗，对肠道菌群的影响等方面进行了研究．

   1. 材料与方法

    乳杆菌

    L.casei Zhang: 由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室分离保存。

    致病性大肠杆菌

 

    大肠杆菌01，7:由内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室保存，

    大肠杆菌Ksa: 由北京市农科院畜牧兽医研究所惠赠。

    试验动物与饲料

    昆明系小白鼠（清洁级），雌雄各半，体重为18一22g，购自内蒙古大学实验动物研究中心。小鼠常规饲料：购自内蒙古大学实验动物中心饲料室。

    方法

    L.casejZhang悬浮液的制备

    将震荡均匀的菌液按I%接种MRS培养液，370C培养18h，经离心(3000r/min、10min）收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤后，在菌体沉淀上加入10％灭菌脱脂乳液：并调整其菌数为2.0×10'ocfu/ml， 混匀后倾注培养，计活菌数确认后备用。

   动物分组与饲养方式 

    随机将小鼠分为6组，每组』8只．常规饲料饲养对照组(l) 和对照组(2)。将L.casei Zhang 制备成2.0×10』0cfu/ml，以表1设计的方案灌服给各试验组小鼠，按各组的设计剂还随体重增加而增量灌服，每E一次，连续灌服。

    

    大肠杆菌的活化将大肠杆菌Oirr和1心在LB液体培养基中3TC培养10h，传代=伏，调整其菌数为2xl08cfuhnl备用．    

    L.case'Zhang的饲喂与攻毒

    各组按1.2.2的饲喂方式进行，在连续饲喂15d时对照组（』）以及A、B、组灌服火肠杆菌om剂逢为0.6ml)只，对照(2)组以及C.旦夕淮服大肠杆菌K88剂』量]：为0.0.6mU只，A、C组停止灌服含活性L.case」 Zhang 菌液，B、D 组继续灌服含活性L.casei Zhang 菌液。连续电5d ，观察并记录各组小 鼠的发病情况。

   大肠杆菌和乳杆菌的分离培养 

    停止灌服乳杆菌菌液第4夭扑杀A、C和对照组未发病的小鼠每组3只，取肠道内容物，用选择性培养基，分离大肠杆菌和乳杆菌」然后挑单个菌落分别进行培养，并加以标记备用。

    大肠杆菌的筛选

    取0.5克新鲜的肠内容物，用l;Oml 无菌的PBS(pH值7.4)悬浮，在制成稀释度为IO"，IO'J，』0.4，，lO's，10.6，10门的悬浮液，取10O弧悬液涂布DHL选择性平板，37"C培养24h后，挑选菌落数在30～300之间的平板，选择右紫黑色金属光泽的典型菌落。在LB平板上两次划线纯化以后，挑单个菌落分别进行培养编号。

   乳杆菌的筛选 

    取0.5克新鲜的肠内容物：用10ml无菌的PBS(pH值7.4）悬浮，在制成稀释度为10"，10'-，10.4，lO.s，」06，10-"的悬浮液，取10Opl悬液涂布LBS选择性平板，3TC厌氧培养36h后，挑选菌落数在30～300之间的平板，选择有白色的典型菌落(，在MRS平板上两次划线纯化以后，挑单个菌落分别进行培养编号。对分离到的火肠杆菌和乳杆菌分别进行多样性分析

    利用ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Sequence -polymerase chain reaction， ERIC-PCR)方法对分离到的)\肠杆菌和乳杆菌分别进行多样性分析。

    菌株培养及总DNA的提取

    采用CTAB法提取菌株基因组总DNA.将分离到的菌株分别接种子TPY液体培养基中，置37'C 培养24h，经TPY培养液传代培养2～3次后，取1.5ml对数生长末期的菌体培养物，4500r/min离DSmin收集菌体，去尽培养液。在沉淀中加入56\ul的TE缓冲液，用吸管反复吹打，使之重悬。然后加入30yl10％SDS(WfV)和3山20mg/ml蛋白酶K混匀，于37℃水浴保温lh。再加入10Op.浓度为lOmol/LCTAB溶液(4.1gNaCl溶于80ml水中缓慢加入CTABlOg)及100pl浓度为0.7mol/LNaCI 1， VlV）， 颠倒混匀，12000r/min离心5min，取上清，并加入7㈨pl氯仿／异戊醇（25：l，VN），颠倒混匀，12000r/min离心Smin，弃'F-层，重复2次。在第二次所得到的上清液中，加入500冷的异丙醇，轻轻混合，直到DNA沉淀-J，-来，I2000r/min离心5min，弃去上清得到DNA沉淀，用lm170％的乙醇(VN）洗涤DNA沉淀2次，并在空气中自然干燥。最后用30～60pl灭菌去离子水溶解DNA，井加入适量RnaseA，40C放置过夜后，置于一200C保存。

   CR扩增 

    扩增引物

    ERIC-PCR引物：上游引物序列ERICl: 5'-ATGTAAGCTCCTGGGA'FT AC-3'。下游引物序列ERIC2:5'-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3'。 由宝生物（大连）有限公司合成。

    扩增体系以及循环参数

    将上述制备的基因组DNA作为PCR扩增的模板，采用25u」反应体系进行PCR扩增，扩增体系为：基因组模板2pl，DEPC9田：预混的EX-Tag酶12.5ptl，引物1.5pl，

    循环参数，9Y  预变性7min, 90℃30sec, 520C Imin, 65qC 8min 35 个循环】65C 延伸16min.

    PCR产物检测

    预先准备1.0%的琼脂糖凝胶，扩增反应完毕后，取5p』的PCR 产物与』山6xLoding buffer混合，加样于琼脂糖胶点样孔中进行电泳，电泳液为0.5xTBE.凝胶电泳后，紫外灯下观察。

    结果

    攻毒后各组小鼠死亡情况

    各组按3.2.2.2的饲喂方式连续饲喂15d时对照组(1）以及A、B组灌服大肠杆菌O'，7剂量为0.6ml/只，对照(2）组以及C、D组灌服火肠杆菌Kss剂量为0.6m岷，A、C组停止灌服含活性乳酸杆菌菌液，B、D组继续灌服含活性乳酸杆菌菌液。连续5d，观察并记录各组小鼠的死亡情况，结果见表2、表3。

 

由表2、可知，对照组(l)小鼠用01，7菌株攻毒后在5d内共死亡12只，死亡率为66.67%，漱服L.case‘Zhang 组死亡3 只，死亡率为16.67%，攻毒后继续灌服L.casei Zhang 组死亡1 只，死亡率为5.56%. 因此滤服L.casei Zhang可以人人降低闪人肠杆菌Om攻毒造成的小鼠死亡，特别是攻毒后继续蒙服L.casei Zhang 可以进一步降低小鼠的死亡率。表3 攻人肠杆菌K88后各组小鼠的，死 亡情况。

 

    由表3可知对照组(2)小鼠用隐8菌株攻毒后在Sd内共死亡3只，死亡率为16.67%，灌服L.case」Zhang组死亡1 只，死亡率为5.56%，攻毒后继续灌服L.casei Zhang组死亡1 只：死亡率为5.56%.冈此灌服L.casei Zhang和攻每后继续灌服L.casei Zhang可以进一步降低风火肠杆菌陷】攻毒造成的小鼠的死亡率，虽然其效果表面上看起来K88不象01，7菌株攻毒F那样明显，这主要可能是KB8 菌株的对小鼠的致死性不及Om菌株强。    

    ERIC-PCR结果

    已知L.casei Zhang和大肠杆菌0157、K88的ERIC-PCR产物屯泳图谱如图1：分离的乳酸蔼及L.casei Zhang和MG2-I 的ERIC-PCR产物电泳图谱如图2：从对照组分离的大肠杆菌以及标准菌株0.，7和k88的ERIC-PCR产物电泳图谱如图3：从A、C组分离的大肠杆菌以及标准菌株0"7和k拈的ERIC-PCR产物电泳图谱如图4.

 

 

 

    由图3可知2、5、7，10、14和15号为同一株菌：8号菌株与L.casefZhang同一株菌。4，12 号菌株与MG2-I为同一菌株。

 

    由图4可知，1和2为同一株菌，7和8为同一株菌，3和14为同一株菌，因为1为01，7，所以2为大肠杆菌om’3为大肠杆菌K88所以14为大肠杆菌K88.

 

圈5 从A、C堪分*的大肠杆竹以及Ou'和ku的ERIC-PCR产物电泳图谱由图5可知，分离到的大肠杆菌ERIC-PCR产物都与大肠杆菌OIS7，k88不同。说明没有分离到大肠杆菌

    讨论

    动物的整个消化道在正常情况下都寄生有大量微生物。就其作用而言，可分为三类：1）共生性类型，主要是兼性厌氧菌：在生态平衡时，它们的微生素和蛋白质合成、消化吸收、生物颉抗和免疫等功能对宿主有利。2)致病性类型，正常情况下数量少，生于正常部位，不至于使宿主发病，失控，则会导致宿主的不良反应.3）中间性类型，即同时具有生理和致病两种作用，其数量增加，导致腐生物质：毒素增加，促进宿主的老化．肠道菌群失调产生的原因很多，如感染、应激、损伤、外籍菌的入侵、抗菌药物、某种菌的过度繁殖等．微生物群的平衡，对机体的健康十分重要，厄乳酸菌就能够调书这种微生态平衡，保障宿主正常生理状态。本试验用L.casei Zhang湼服小鼠后用大肠杆菌攻毒结果可知，对照组小鼠用Om菌株攻毒后在Sd 共死亡12只，死亡率为66.67%，用K鹞菌株攻毒后在Sd内共死亡3只：死亡率为16.67%，灌服L.casei Ihang可以大大降低因大肠杆菌O旧和Kss攻毒造成的小鼠死亡，此二组Sd内的死亡率分别为16.67％和5.56%.特别是攻毒后继续灌服L.caseiZhang可以进一步降低小鼠的死亡率。虽然其效果表面上看起米1锄菌株不象O旧菌株攻毒那样明显，这主要可能是K88菌株对小鼠的致死性不及oi'7菌株强。

一般同种细菌的rRNA区域高度保守4.5 ：而非编码基冈重复序列具有很强的个体差异，所以可以用ERIC-PCR来反映肠道内火肠杆菌、乳酸杆菌不同菌株间的多样性(6，7，8.9)。从本试验看，我们以分离钊的夫肠杆菌和乳酸菌菌株以及和标准菌株的DNA为模板进行ERIC-PCR扩增，扩增产物的电泳图显示火多数分离菌株间的ERIC-PCR图谱有差异，表明ERIC-PCR分析可以揭示非常丰富的个体水平上的多样性．根据分离株间的图谱的异同，来判断是否由图2可知在停止饲喂乳酸杆菌的第4天在小鼠的肠道内分离出了L.case」Zhang菌株。说明在停止饲喂L，case」Zhang后4d仍然右L.casei2hang菌株在小鼠肠道内定植。由图3可知，在攻毒后的第4天在对照组分离到了目标菌Om和k88菌株，由图4可知，灌服乳杆菌组没有分离到大肠杆菌O157和K88菌株，这说明在灌服l.caseiZhang对大肠杆菌O157和K88驱的抑制从而使其在数量下降，因此没有被分离到．

乳杆菌在预防肠道疾病及治疗腹泻方面有着重要意义。乳杆菌逍过磷壁酸与肠粘膜上皮细胞形成一个生理屏障，提高定植阻力，对致病菌和条件致病菌的入侵有抗作用[10]。许多的试验及实际应用都证实了这点。本试验中，通过对小鼠的试验也得出了同样的结果。

    小结

    灌服L.caseiZhang可以大大降低因大肠杆菌O517、K88攻毒造成的小鼠死亡，特别是攻毒后继续淮服L.caseZhang可以进一步降低小鼠的死亡率。1）因L.casei Zhang具有肠道内抑制大肠杆菌作用。2)  停止饲喂L.casei Zhang的第4天在小鼠的肠道内分离出了L.casei Zhang. 说明L.casei Zhang菌株在小鼠肠道内定植存活至少4d以上，对肠道菌群具有调节作用。3) ERIC-PCR扩增图谱分析，可以揭示非常丰富的个体水平上的多样性，可以应用ERIC-PCR扩增图谱分析进行肠道菌群结构分析和饲喂菌的跟踪分析。 

    短小乳杆菌s-层蛋白信号肽基因的克隆及特性分析

    1．材料

    I.I菌种和质粒：E.coliJM109，由河南科技大学动物检疫实验室保存：短小乳杆菌L.2028，购自中科院菌种保藏中心：质粒pMD18-TSimple购自大连宝生物]r.程有限公司。.2 主要试剂：聚合酶PyrobestTM DNA Polymerase、dNTP、限制性内切鹊Xbal、Kpn l、Sacl、等购自大连宝生物公司：异丙基·6D4=氯.3.吲哚半乳糖苷(X-ga』)、异丙基-p-D-硫代半乳糖苷（』PTG）均购臼上海华美生物工程公司：DNAL·xlerl00-IOOO、DL2000、PCR同收试剂盒和质粒纯化试剂盒购。