内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室 

2014.05 

 

     乳双歧杆菌V9（Bifidobacterium animalis subsp. lactis V9，Bifidobacterium lactis V9，B. lactis V9）是内蒙古农业大学“乳品生物技术与工程”教育部重点实验室研究人员于2005年从健康蒙古族儿童肠道中分离筛选出的1株性能卓越的益生菌。研究人员采用体外实验、动物模型和临床试验对Bifidobacterium lactis V9 的益生功能进行了系统评价（图1），并利用基因组学的手段对Bifidobacterium lactis V9的益生机制进行了深入剖析。经过多年系统的基础研究，自主解决了其产业化的关键技术问题，包括直投式发酵剂、发酵豆乳益生菌饮料、发酵乳制品、益生菌奶粉、益生菌固体饮料、益生菌片剂和益生菌胶囊等产品，并实现了产业化。相关研究开发报告分类目录如下： 

1． Bifidobacterium lactis V9的分离与筛选 

2． Bifidobacterium lactis V9的益生功能评价 

 

a) Bifidobacterium lactis V9对肠道致病菌的拮抗作用 b) Bifidobacterium lactis V9对腹泻动物的保护作用 c) Bifidobacterium lactis V9对便秘和腹泻患者的临床研究 

3． Bifidobacterium lactis V9基因组学研究 

4． Bifidobacterium lactis V9直投式发酵剂的开发及产业化 

5． Bifidobacterium lactis V9在发酵豆乳制品、发酵乳制品中的研究开发及产业化 

6． Bifidobacterium lactis V9在益生菌奶粉、益生菌片剂、益生菌固体饮料及益生菌胶囊等健康食品中的研究开发及产业化 

7． Bifidobacterium lactis V9研究开发获得的奖励 

8． Bifidobacterium lactis V9相关的发明专利和发表的研究论文

 

Bifidobacterium lactis V9研究开发摘要 

1. Bifidobacterium lactis V9的分离与筛选[1] 

 

     Bifidobacterium lactis V9是2005年分离自内蒙古草原上健康蒙古族儿童肠道中的一株具有优良益生特性的乳双歧杆菌（图2~图5）。

 

     Bifidobacterium lactis V9是从内蒙古农业大学乳酸菌菌种资源库（中国第一个最大的原创性乳酸菌菌种资源库，保藏乳酸菌3,388株）保藏的31株双歧杆菌中优选的1株具有优良益生特性的乳双歧杆菌。该菌株在消化系统中具有优异的耐受胃酸、肠液和胆盐能力。 Bifidobacterium lactis V9在pH2.0的人工胃液中消化3小时后继续在pH8.0的人工肠液中消化8小时，其存活率高达92.44% ，实验结果见图6。Bifidobacterium lactis V9可耐受的最大胆盐浓度为0.3g/100mL。

 

图6 B. lactis V9在人工消化系统中的耐受能力 

    采用分子生物学手段16S rDNA对Bifidobacterium lactis V9进行鉴定，通过PCR产物直接测序，获得长度为1,433bp的16S rDNA序列。通过NCBI BLAST比对分析，发现与Bifidobacterium animalis subsp. lactis 模式菌株Bifidobacterium animalis subsp. lactis DSM 10140和益生菌株Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB12的同源性为99%。运用专业软件Mege 4.0构建Bifidobacterium属内31个种以及Bifidobacterium lactis V9的系统发育树，如图7所示。

 

 

2. Bifidobacterium lactis V9的益生功能评价 

2.1 Bifidobacterium lactis V9对肠道致病菌的拮抗作用[2] 

    将Bifidobacterium lactis V9分别与肠道致病菌（志贺氏痢疾杆菌Shigella Shigae、鼠伤寒沙门氏菌Salmonella Typhimurium、大肠埃希氏菌Escherichia Coli、铜绿假单胞菌Pseudomonas Aeruginosa）在TPY培养基中37 ℃两两混合培养，定时取样计数。Bifidobacterium lactis V9与4种肠道致病菌两两共同培养60h后，供试肠道致病菌均未检出，而Bifidobacterium lactis V9活菌数量仍未明显降低（P<0.05），实验数据见图8。这一研究结果表明，Bifidobacterium lactis V9对肠道致病菌具有显著的拮抗作用（P<0.05）。

 

2.2 Bifidobacterium lactis V9对腹泻动物的保护作用[2] 

     以腹泻小鼠（抗生素和肠道致泄菌）为模型，用Bifidobacterium lactis V9喂食小鼠3d（低剂量组（L） ：2.0×107 CFU/d、中剂量组（M） ：4.0×107 CFU/d、高剂量组（H） ：1.0×108 CFU/d）。结果显示：随Bifidobacterium lactis V9喂食剂量的增加，小鼠粪便和盲肠内容物中肠杆菌活菌数均显著减少（P<0.01），类杆菌、乳杆菌和双歧杆菌数量均显著增加（P< 0.01），实验数据见图9；

Bifidobacterium lactis V9可显著提高腹泻康复率（P<0.01），同时显著降低腹泻死亡率（P<0.01）， 可以有效治疗腹泻，实验数据见图10。

 

2.3 Bifidobacterium lactis V9对便秘和腹泻患者的临床研究[6] 

     以Bifidobacterium lactis V9为研究对象，对153例患有便秘或急慢性腹泻患者进行21d的临床治疗（1.0× 1010CFU/d）。治疗期间，每3天记录一次受试患者的排便频率和粪便形态，并在试验前和试验后采集粪便，测定受试患者体内主要肠道菌群的变化情况。试验结果表明， Bifidobacterium lactis V9可有效治疗便秘、急性腹泻和慢性腹泻，临床治疗有效率分别为95.3%、95.4%和89.9%，实验结果见图11。

    与试验前相比，患者粪便中双歧杆菌数量显著增加（P< 0.01），肠杆菌、肠球菌、拟杆菌和产气荚膜杆菌的数量也发生了显著的变化（P< 0.01），更加趋向于健康人群的肠道菌群结构，实验结果见图12，试验结果表明：Bifidobacterium lactis V9可以使人体肠道菌群结构健康化。

 

3．Bifidobacterium lactis V9基因组学研究[7] 

     2009年，采用全基因组鸟枪法测定了Bifidobacterium lactis V9全基因组序列并进行了功能基因组学分析（GenBank登录号：CP0018 92）。结果表明：Bifidobacterium lactis V9 染色体基因组为环状分子，平均G+C 含量为60.5%，染色体的长度为1,944,050 bp，分析得到了1,636 个开放可读框（ORF），其中1,572 个编码区（CDSs）可以被赋予潜在的生物学功能（图13）。

  

Bifidobacterium lactis V9 基因组含有4 个rRNA 操纵子，每个操纵子均由单一拷贝的5S、16S、23S 组成。Bifidobacterium lactis V9基因组还编码52个tRNA 基因，分布在基因组37个不同位置。通过对益生菌Bifidobacterium lactis V9 基因组全序列与其他8 株双歧杆菌全基因组序列的比较，发现乳双歧杆菌种内遗传稳定，突变重组较少，并且保持良好的线性关系（图14）。

 

    通过分析Bifidobacterium lactis V9基因组插入、缺失及SNP位点，可得Bifidobacterium lactis V9基因组中仅有一个由于复制过程中出现的基因水平转移形成的大小约为4,037bp 的插入片段。同时，Bifidobacterium lactis V9的保守性较强，SNP多态性极少。依据其SNP 位点、插入、缺失等信息，构建4 株动物双歧杆菌乳酸亚种的进化分化关系，得出该菌株遗传极为稳定，在菌株传代保藏过程中发生重组、突变几率极小，从而为Bifidobacterium lactis V9的安全生产和使用提供保障，（图15）。

 

    通过分析发现，在已知9株双歧杆菌中，均出现数量较多编码低聚糖利用的相关基因，从基因水平解析了双歧杆菌利用低聚糖能力强的原因（图16）。此外，在Bifidobacterium lactis V9基因组中预测到NADH Oxidase同工酶以及编码具有氧化损伤修复功能蛋白的基因，可以推测Bifidobacterium lactis V9在微厌氧环境中继续生长主要是由于NADH Oxidase同工酶和氧化损伤修复蛋白。同时，这一特性也大大降低了Bifidobacterium lactis V9 发酵剂生产的成本，有利于该菌株的规模化生产。

 

4．Bifidobacterium lactis V9直投式发酵剂的开发及产业化 

    根据Bifidobacterium lactis V9的代谢分子机制和营养需求，对增菌培养基成分和含量进行筛选和优化，确定了Bifidobacterium lactis V9的高密度发酵工艺，发酵液中活菌数大于 3.0×109 CFU/mL。 

抗冷冻方面的研究中，发现在冷冻干燥过程中，糖类的添加对 Bifidobacterium lactis V9细胞膜的zeta电位、疏水性、流动性和完整性均有不同程度的影响，在此基础上开发出了适合Bifidobacterium lactis V9冷冻干燥的有效抗冻保护剂。 

    基于上述研究，Bifidobacterium lactis V9经真空冷冻干燥可得到活菌2.0×1011 CFU/g以上的高活力发酵剂，可以满足益生菌制剂和各类发酵制品的工业化生产要求。 

    2010年 6月，合作企业投资6000万人民币，成功的将Bifidobacterium lactis V9发酵剂进行了工业化生产，产品中活菌数大于2.0×1011 CFU/g，达到国际同类产品水平（图17-图20）。

 

5. Bifidobacterium lactis V9在发酵豆乳制品、发酵乳制品中的研究开发及产业化 

5.1 Bifidobacterium lactis V9在豆乳和牛乳中的发酵及贮藏特性的研究[8-13] 

    将Bifidobacterium lactis V9按2.0×106CFU/mL接种量接种于豆乳中，37℃恒温发酵。结果显示：至发酵终点（pH 4.2）时，其活菌数达1.58×109 CFU/mL；将发酵豆乳在4℃下贮藏28天，其活菌数仍可保持4.26×108 CFU/mL；游离氨基酸（FAN）由发酵初始的6mmol/L增加至发酵结束时的17mmol/L；豆乳发酵过程中，Bifidobacterium lactis V9可以促使无活性的异黄酮可转化为功能性活性异黄酮（黄豆甙元、黄豆黄素、染料木素）实验数据见图21；发酵豆乳具有良好的口感和风味。

 

    Bifidobacterium lactis V9按1.0×106CFU/mL接种量接种于牛乳中，37℃恒温发酵，至发酵终点（pH 4.5）时，其活菌数可达1.44×109 CFU/mL（图22），将发酵牛乳在4℃下贮藏28天，Bifidobacterium lactis V9在活菌数仍高达6.76×108CFU/mL，活菌数无明显降低。这一结果说明牛乳也同样适合Bifidobacterium lactis V9的生长。

在不同气体环境对Bifidobacterium lactis V9生长影响的研究中，发现在N2：H2：O2=80:10:10的混合气体环境下有利于Bifidobacterium lactis V9在液体MRS和脱脂乳中的生长，其活菌数可以增加0.5-1个数量级。这一研究结果可以为发酵乳的生产和产品中Bifidobacterium lactis V9活菌培养计数提供指导,试验结果见图23。

 

5.2 Bifidobacterium lactis V9在发酵豆乳饮料中的产业化应用 

    根据上述基础研究数据，建立并优化了Bifidobacterium lactis V9发酵豆乳益生菌饮料的生产工艺。2010年，采用独特的2段发酵工艺，Bifidobacterium lactis V9益生菌发酵豆乳饮料—百益多（Bifidobacterium lactis V9与Lactobacillus casei Zhang共同发酵，图24）在青岛君益食品有限公司投产，产品中活菌数（Bifidobacterium lactis V9和Lactobacillus casei Zhang）达到 580亿CFU/100mL，是目前我国市场上益生菌饮料中最高活菌数的5倍，且在产品货架期内活菌数一直保持不变。

 

6. Bifidobacterium lactis V9在益生菌奶粉、益生菌片剂、益生菌固体饮料和益生菌胶囊等健康食品中的应用与产业化 

    2012年，Bifidobacterium lactis V9成功地应用于内蒙古伊利集团中老年益生菌奶粉中，伊利集团中老年益生菌奶粉产品见图25。

 

    根据Bifidobacterium lactis V9优良的益生特性和贮藏稳定性，北京和美科盛生物技术有限公司推出了含有Bifidobacterium lactis V9的复合益生菌片—益生和美（含B. lactis V9、L. casei Zhang和L.plantarum P-8，总活菌数大于3000亿CFU/100g，其中Bifidobacterium lactis V9含量大于1000亿CFU/100g）（图26）。

 

    北京中研万通科技中心营养食品公司陆续推出了含有Bifido bacterium lactis V9复合益生菌冻干粉—给力1号（含Bifidobacterium lactis V9高达1000亿CFU/100g）和复合益生菌胶囊—肠寿（含Bifidobacterium lactis V9高达1000亿CFU/100g），产品见图27、图28。

 

 

    北京灵君康美生物科技有限公司陆续推出了含有Bifidobacterium lactis V9的超级益生菌组合—LA片剂(含Bifidobacterium lactis V9高达1000亿CFU/100g)和LA固体饮料(含Bifidobacterium lactis V9高达5000亿CFU/100g)，产品见图29、图30。

 

7. Bifidobacterium lactis V9研究开发获得的奖励 

    2009年，“功能性益生乳酸菌高效筛选及应用关键技术”获国家科技进步二等奖（证书号：2009-J-251-2-10-D04），证书见图31。2012年, “双歧杆菌v9的创新研究及产业化开发”获内蒙古自治区科技进步一等奖（证书号：2012-J-006-1-06-R1），证书见图32。

图31 B. lactis V9的研究开发成果获国家科技进步二等奖 

 

 

8. Bifidobacterium lactis V9相关的发明专利和研究论文 

进入审核阶段的发明专利13项（截止到2014年05月）： 

(1) 一株动物双歧杆菌乳酸亚种及其在益生菌酸乳制品中的应用；申请号：201210080795.2； 

(2) 一株动物双歧杆菌乳酸亚种及其在缓解肠易激综合症中的应用；申请号：201210080794.8； 

(3) 动物双歧杆菌乳酸亚种V9中肽-甲硫氨酸亚砜还原酶的核酸序列和氨基酸序列；申请号：201210081114.4； 

(4) 动物双歧杆菌乳酸亚种V9的NADH氧化酶的核酸序列和氨基酸序列；申请号：201210081252.2； 

(5) 动物双歧杆菌乳酸亚种V9中硫氧还原蛋白过氧化物酶的核酸序列和氨基酸序列；申请号：201210081253.7； 

(6) 以干酪乳杆菌和双歧杆菌制备的豆乳饮料及制备方法；申请号：201210006129.4； 

(7) 有效缓解便秘的复合益生菌发酵豆乳饮料及制备方法；申请号：201210006200.9； 

(8) 有效降低血脂的复合益生菌发酵豆乳饮料及制备方法；申请号：201210005614.X； 

(9) 有效缓解酒精性肝损伤的复合益生菌发酵豆乳饮料及制备方法；申请号：

201210005581.9； 

 

(10) 一种能在豆乳发酵过程中转化异黄酮的双歧杆菌；申请号：201210005611.6; 

(11) 一种双歧乳杆菌的高密度培养方法及其冻干菌粉制备; 申请号：201410123146.5; 

(12) 一种全燕麦固态混菌发酵生产益生菌活菌粉剂及其制备方法; 申请号: 201410123174.7; 

(13) 含有植物乳杆菌、乳双歧杆菌的益生菌剂及其制备方法; 申请号: 201410121428.1。 

发表的研究论文（截止到2014年05月）： 

1. 高鹏飞, 孙志宏, 麻士卫, 王秋实, 高杰, 邓承远, 张和平. 蒙古族儿童源良好益生特性双歧杆菌的筛选及鉴定. 微生物学报, 2009, 49(2): 210-216. 

2. 高鹏飞, 孙志宏, 麻士卫, 王秋实, 高杰, 邓承远, 张和平. B. animalis V9对腹泻动物的保护性作用及其机理研究. 中国微生态学杂志,2009,21(5): 385-387. 

3. 麻士卫, 陈霞, 高鹏飞, 孙洁宇, 赵虎云, 邓承远, 高杰, 张和平.B. animalis V9质粒检测及抗生素敏感性试验. 中国微生态学杂志, 2009, 21: 792-795. 

4. 梁春梅, 高鹏飞, 陈霞, 王记成, 王秋实, 高杰, 张和平. 益生菌 B. animalis V9 冻干粉安全性毒理学研究.中国微生态学杂志,2010, 22(06):481-484. 

5. 李永宁，梁春来，张馨，贾旭东. 动物双歧杆菌V9亚慢性毒性研究. 中国

食品卫生杂志,2012,24(3):205-208. 

6. 王记成, 高鹏飞, 周琦, 王秋实, 赵虎云, 张和平. 双歧杆菌V9对便秘和腹泻患者的临床研究. 营养学报, 2011, 1:76-80. 

7. Zhihong Sun, Xia Chen, Jicheng Wang, Pengfei Gao, Zhemin Zhou, Yi Ren, Tiansong Sun, Lei Wang, He Meng, Wei Chen, Heping Zhang, Complete genome sequence of probiotic Bifidobacterium animalis subsp. lactis strain V9. Journal of Bacteriology, 2010, 192: 4080-4081. 

8. 其木格苏都, 王记成, 张家超, 张和平. 荧光定量PCR 法检测益生菌饮料中

 

Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9. 中国乳品工业,2011, 39(12):31-33. 

9. 张青, 张和平. 满益生菌Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium animalis V9在豆乳中生长及活性豆乳饮料中存活性研究. 河套大学学报,2011,8(4):67-75. 

10. 其木格苏都, 王记成, 孟和毕力格, 张和平. 益生菌Lactobacillus casei Zhang

19 / 19 

 

和Bifidobacterium lactis V9接种比例及乳固形物含量对其发酵及储存过程中活菌数的影响. 中国乳品工业,2012,40(1):11-13. 

11. 其木格苏都, 白梅, 孔亚楠, 魏爱斌，王记成，张和平. 不同气体环境对益生菌Bifidobacterium lactis V9生长的影响. 微生物学通报,2012,39(7):931-939. 

12. 李慧，白梅，王记成，魏爱彬，孔亚楠，张和平，孙天松. Lactobacillus delbrueckii 

 

subsp. bulgaricus和Streptococcus thermophilus接种比例对Bifidobacterium lactis益生菌发酵乳品质的影响. 2012,40(3):7-10. 

13. 刘彪, 张和平. Lactobacillus casei Zhang和Bifidobacterium lactis V9在益生菌酸乳中的应用. 中国乳品工业,2012,40(10):4-7. 

14. 刘彪, 张和平. Bifidobacterium lactis V9在脱脂乳粉中贮藏稳定性的研究. 中国乳品工业,2012,40(12):4-7.