10 年前，当人类基因组计划顺利完成时，整个科学界都为之轰动———“生命密码”被破译，人类对自己的认识将愈发深刻。当科学家以为人类所有问题将迎刃而解的时候，更多的事实却悄悄地指向一个被忽视的领域———肠道菌群。正常人体内存在大量的共生菌群，这些细菌大部分寄生在人的肠道中，超过 1 000 万亿个，是人体细胞总数的 10 倍。其微生物基因数量约 300 万个，大约是人类基因组基因数量的 100 多倍。如此海量的基因能够帮助微生物适应多变的环境，同时形成了与人体密不可分的互惠共生关系[1]。研究发现，不同肠道微生物结构和组成影响着宿主的营养物质加工、能量平衡、免疫功能、胃肠道发育及其它多种重要的生理活动。同时，研究发现糖尿病[2-3]、肥胖症[4-6]、高血压[7]等代谢类疾病的患者的肠道菌群结构有别于健康人群。虽然目前还不清楚究竟是肠道微生物菌群的变化引起了代谢类疾病的发生，还是代谢类疾病的发生导致了肠道微生物菌群的变化，但是有一点可以肯定：通过改变肠道微生物菌群的构成，对人体的健康产生影响，同时也可能对某些疾病的治疗提供帮助。人体生物学是由人体基因组和人体微生物组两部分组成的，其中人体基因组的改变是极为困难的，但是人体肠道内微生物构成的改变相对比较容易[8]。饮食、抗生素类药物以及环境等因素均可以影响个体肠道菌群的组成[9-11]，其中以饮食因素影响最大。大量的研究发现，直接服用富含益生菌菌株的胶囊及其发酵乳制品，可以将大量活性益生菌菌株送达人体肠道，从而直接并有效地对人体的肠道微生物组成产生影响。

益生菌（Probiotic），源于希腊语“对生命有益”，是定植于人体肠道内，能产生确切健康功效的活的有益微生物的总称。早在上个世纪初（1907年），著名细菌学家、诺贝尔奖得主梅切尼科夫即提出益生菌可以延年益寿的假说。益生菌主要包括乳杆菌（Lactobacillus）和双歧杆菌（Bifidobac-terium）[12]，其益生作用主要是通过直接或者间接的调整宿主肠道微生物的组成，激活宿主内源性

微生物群或者免疫系统的活性来实现的。口服益生菌能够治愈或缓解多种胃肠道或与胃肠道相关的疾病。目前研究证实口服益生菌有助于缓解乳糖不耐症，预防或者治愈胃肠炎（gastroenteritis）、抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diar-rhea）、旅行性腹泻（traveler’ s diarrhea）、便秘（constipation）及肠道感染（intestinal infections），同时可抑制有害微生物在宿主肠道中定植，对肠易激综合征（irritable bowel syndrome， IBS）、炎症性肠炎（inflammatorybowel disease， IBD）及结肠癌（colon cancer）等肠道相关性疾病具有良好的预防和治疗作用[13-16]。近年来，关于益生菌菌株对肠道菌群影响的研究报告越来越多，新的研究手段也不断呈现，益生菌对肠道菌群的影响已经成为益生菌及相关领域的研究热点。本文在概述国内外关于益生菌影响肠道菌群研究现状的基础上，以 1 株具有完全自主知识产权并已成功实施产业化应用的益生菌菌株———Lactobacillus casei Zhang 为例，详实说明益生菌对人肠道菌群的影响。

1国内外关于益生菌对肠道菌群影响的研究现状

1.1肠道微生物构成研究手段和技术

传统肠道菌群的研究主要是建立在纯培养技术之上的，然而这些方法耗时、费力，操作复杂，并且受到培养条件的约束，不能全面、客观地反映肠道菌群的真实情况。分子生物学技术的快速发展为肠道菌群研究提供了全新的方法和思维，特别是宏基因组理论的提出以及与之相结合的技术逐步问世，诸如变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）和荧光定量 PCR 技术（RT-PCR）等，提供了成套的基于非培养的微生物研究技术。

变性梯度凝胶电泳（DGGE）是近几年来肠道菌群多样性及肠道菌群变化研究运用较多的一项技术。PCR-DGGE 最先由德国的 Muyzer 等[18]应用于微生物领域的研究，其原理是扩增 16S rDNA多变区基因序列，利用不同 DNA 片段解链条件以及梯度变性胶等特性，完成对碱基组成不同的DNA 片段的分离。该方法省时、省力、操作简便、灵敏度高，可检测到一个核苷酸水平的差异。

2001 年，Satokari 等[19]应用该技术配合种属特异性引物，对健康人粪便中双歧杆菌属的多样性进行了研究。通过对 DGGE 图谱中特异性条带的测序，发现青春双岐杆菌（Bifidobacteriumadoles-centis）、动物双歧杆菌（Bifidobacteriumanimalis）、长双歧杆菌（Bifidobacteriumlongum）、链状双歧杆菌（Bifidobacteriumcatenulatum）、角形双歧杆菌（Bifidobacteriumangulatum）、两歧双歧杆菌（Bifi-dobacteriumbifidum）在人体肠道中普遍存在，而两歧双歧杆菌是优势菌群。同年，Walter 等[20]应用乳杆菌特异性引物和 DGGE 技术揭示了人肠道内乳杆菌的多样性，其研究结果表明，嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、加氏乳杆菌（Lacto-bacillus gasseri）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）和干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）在人肠道内大量存在。 2004 年，Bartosch 等[21]使用RT-PCR 和 DGGE 相结合的方法对健康老人和长期服用抗生素类药物老人的肠道菌群进行了分析。结果表明，健康老人肠道菌群的种类和有益菌群的数量明显高于长期服用抗生素类药物的老人。

实时荧光定量PCR（Real-time Polymerase Chain Reaction）技术于1996 年由美国 Applied Biosys-tems 公司推出，该技术的问世实现了 PCR 从定性分析到定量分析的飞跃。近年来，由于该方法高效、准确的定量特性，被广泛用于肠道微生物菌群中某些特定菌群的定量分析。2004年，Matsuki等[22]应用该技术和荧光原位杂交技术（FISH）对 6名健康志愿者肠道内的 6 种优势菌群进行了定量分析，结果表明球形梭菌（Clostridia coccoides）的含量为 10.4 log cfu/g，柔嫩梭菌（Clostridia leptum）为 10.1 log cfu/g，脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）为 10.7 log cfu/g，Bifidobacterium 为 9.8 log cfu/g，奇异菌属（Atopobium cluster）为 9.9 log cfu/g，普氏菌属（Prevotella）为 10.1 log cfu/g。 2006 年，荷兰瓦格宁根大学Haarman 等[23]应用该技术监测 3 组婴儿在服用含有益生菌配方奶粉后肠道内 8 种乳杆菌数量和比例的变化情况。监测结果表明，在服用含有益生菌的奶粉后婴儿肠道内嗜酸乳杆菌数量明显增加，而其它几种乳杆菌变化不明显，但总的乳杆菌数量略有提升。

尽管这些方法的应用为人们认识肠道微生物生态学提供了新的视角，然而这些方法并不能让研究人员在一次试验中全面、平行分析多个样本中的微生物群落信息，因而也不能对不同来源的多样本间微生物分子生态学进行关联分析。

第 2 代测序仪 Recho 454———焦磷酸测序平台（Pyrosequencing）的出现为全面、快速、准确地研究微生态环境中微生物多样性提供了新的方法。2005 年，Margulies 等[24]优化、改良 Recho 454测序技术，并用来进行 SNP 检测和微生物群落多样性分析。虽然这一方法可以在一次测序试验中获得大量序列，但不能在一次试验中平行分析多个样本。为了克服这一缺陷，人们在焦磷酸测序前为每个样品加上一段 8～10个被称作样品特异性条形码（barcode）或者标签（Tag）的核苷酸序列，这样就可以实现高通量、多样本的平行试验[25]。这种方法被称为多重条形码焦磷酸测序技术（Multi-plex barcoded pyrosequencing），该方法的应用可以在一次实验中分析多个样本，大大节约了实验成本，提高实验效率，并且可以实现不同样本间的关联分析[26]。由此，这一技术已广泛应用到深矿井、土壤、深海生物圈、慢性创伤部位、人类口腔及肠道等微生态环境中微生物多样性的检测和研究中。

2010 年，De Filippo 等[27]应用焦磷酸测序技术对 15 名欧洲儿童和 14 名非洲布基纳法索儿童的肠道菌群进行了研究，结果表明，饮食习惯和环境差异均对肠道菌群的组成有较大影响。在非洲布基纳法索儿童的肠道内，拟杆菌门和硬壁菌门的比例为 73∶27，而这一比例在欧洲儿童的肠道内为 27∶73。同年，Dethlefsen 等[28]采用同样的方法分析了使用抗生素 10 个月期间人肠道微生物的变化。在环丙沙星的 2 个治疗疗程中，菌群组成总体平衡，略有增减，但每个疗程的药物治疗都会打破这种平衡，其中一位受试者接受环丙沙星治疗后完全失去了一种普通细菌，在研究期间再也没有恢复。此外还发现肠道中双歧杆菌数量均显著增加，乳杆菌数量极显著的增加，表明食用降低热值的糖替代物可改善肠道健康。上述实验表明抗生素可以导致人肠道中定居细菌的长期改变。2010年，Beards 等[29]评估了非消化性碳水化合物制成的低能量巧克力对肠道菌群是否具有调节作用，结果发现肠道中双歧杆菌数量均显著增加，乳酸菌数量极显著增加，表明食用降低热值的糖替代物可改善肠道健康。

综上所述，DGGE 技术省时、省力、操作简便、灵敏度高，通过对电泳图谱的观察就可以达到判定肠道菌群差异的目的，而对差异条带的回收测序便可以完成定性分析。 RT-PCR 技术特异性强，定量分析结果准确，非常适用于肠道内优势菌群以及某个特定菌群的定量分析。焦磷酸测序技术是目前国际上肠道菌群研究的主流技术，分析结果非常全面、准确，自动化程度高，外源污染甚少。结合以上 3 种前沿的分子生物学技术，可快速、准确地实现肠道微生物的定性和定量分析。

1.2益生菌对肠道菌群影响的研究现状

益生菌对肠道菌群的影响可以分为直接影响和间接影响。直接影响是指某些益生菌的摄入可以直接改变肠道内固有菌群的结构；间接影响是指益生菌的摄入可能影响某些肠道菌群的代谢，进而改变肠道中短链脂肪酸（SCFA）和总胆汁酸（TBA）的含量以及细菌酶活性和矿物质离子的吸收。

1.2.1

益生菌的摄入影响肠道菌群结构目前已知人体肠道内栖息着几百种不同种类的微生物。肠道内可培养的革兰阴性杆菌（Gram-negativerods）主要属于脆弱拟杆菌族（Bacteroides fragilis group），而其它革兰阳性杆菌和球菌主要包括双歧杆菌属（Bifidobacteria）、梭菌属（Clostridia）、消化球菌属（Peptococci）、链球菌属（Streptococci）、真细菌属（Eubacteria）、乳杆菌属（Lactobacilli）、消化链球菌属（Peptostreptococci）、瘤胃球菌属（Ruminococci）、肠球菌属（Enterococci）、大肠杆菌类（Coliforms）、产甲烷菌（Methanogens）、异化硫酸盐还原细菌（Dissimilattory Sulfate-Reducing bac-teria）和产乙酸菌（Acetogens），其中有一部分微生物对宿主健康是有益的，而另一部分微生物可能起到相反的作用。通过促进有益菌的繁殖和抑制有害菌的生长，益生菌在改变宿主肠道菌群的同时，也使其自身的益生特性得到发挥。近年来关于益生菌对肠道微生物构成影响的研究结果列于表 1。

1.2.2

益生菌的摄入对短链脂肪酸（short chain fatty acids，SCFA）代谢水平的影响短链脂肪酸是指碳链为 1～6 的有机脂肪酸。通常短链脂肪酸包括乙酸、丙酸和丁酸，它们是人结肠细菌发酵的主要产物。 SCFA 是结肠腔内重要的有机酸阴离子，通过离子或非离子形式被结肠粘膜吸收，是结肠和小肠上皮细胞的主要供能物质。SCFA 可以促进钠离子吸收、结肠细胞增殖和粘膜生长，提供代谢能源，增加肠血流，刺激胃肠激素生成，是结肠粘膜的重要营养素。临床研究表明，SCFA能较强地维护肠道形态及功能，并具有一定的治疗作用，可以缓解和治疗转流性结肠炎、远段溃疡性结肠炎、袋囊炎、放射性结肠炎、短肠综合征、全肠外营养所致肠失用等多种肠道外科疾病。通过测定肠道内 SCFA 的水平，间接反映体内微生物群落的变化。 SCFA 的含量也可以反映细菌活性，因此，SCFA 成为研究益生菌对肠道微生物影响的重要指标。

在 Sakata 的研究中[37]，试验人员将 4 种益生菌添加到猪饲料中，通过一段时间的饲喂后对猪盲肠中SCFA 进行测定，结果显示，SCFA、乳酸盐和琥珀酸盐的含量明显增加。这一现象产生的原因是因为益生菌的摄入加快了碳水化合物的分解，进而影响短链脂肪酸的合成。2005 年，Schneider[38]给健康志愿者和肠道疾病志愿者食用酵母益生菌 Saccharomycesboulardii 6 d，然后研究受试者粪便中短链脂肪酸含量的变化。研究结果表明，酵母益生菌 Saccharomyces boulardii 可以显著增加患肠道疾病志愿者体内 SCFA 含量，而对健康志愿者的作用不明显。

1.2.3益生菌的摄入对总胆汁酸（TBA）代谢的影响胆汁酸（Bile Acids）是一大类胆烷酸的总称，以钠盐或钾盐的形式存在。它们是双亲性的胆固醇代谢产物，在肝脏中合成，贮存于胆囊中，然后释放到小肠中。胆汁酸可以分为初级胆汁酸和次级胆汁酸，粪便中存在的主要是次级胆汁酸，即：脱氧胆酸（deoxycholic acid， DCA）、鹅脱氧胆酸（chenodeoxycholicacid， CDCA）和石胆酸（litho-cholic acid， LCA）。研究表明，次级胆汁酸是恶性肿瘤的启动子，对人体危害众多，而某些乳杆菌和双歧杆菌的摄入可以降低粪便中该物质的含量。其机理可能是益生菌抑制了肠道中梭菌属的生长，而梭菌属恰恰能够将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸。

多数研究认为益生菌的摄入可以降低初级胆汁酸转化为次级胆汁酸的比率，进而减少次级胆汁酸的含量[39-40]。Zampa 等研究证实，当在志愿者饮食中补充双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳杆菌（Lactobacillus）时，志愿者粪便中的总胆汁酸含量显著下降[41]。类似的影响同样存在于大鼠模型中[33]。

1.2.4

益生菌的摄入对肠道细菌酶活力的影响

细菌酶种类众多，在具体研究中以研究β-葡萄糖醛酸酶（β-GCD）居多。当机体发生恶性肿瘤病变时，粪便中该酶活性增高。多数研究表明，益生菌的摄入可以降低该酶的活性，间接说明益生菌在一定程度上具有抗癌作用[43-46]。然而这一结果尚存争议。另一些研究认为摄入益生菌对细菌酶的活力并无影响[47-49]。Spanhaak[46]的研究结果表明，摄入干酪乳杆菌代田株可以显著降低β-葡萄糖醛酸酶水平，然而 De Preter 的研究结果却显示该菌株并无此功效[47]。这种现象的产生可能是由于受试人群不同，肠道菌群差异较大，因此对该益生菌摄入后的应答出入较大。

1.2.5

益生菌的摄入对肠道内矿物质吸收的影响

矿物质和维生素一样，是人体必需的元素，且矿物质是无法自身产生和合成的。矿物质的吸收可以维持机体的酸碱平衡及组织细胞渗透压，维持神经肌肉兴奋性和细胞膜的通透性，并且是某些具有特殊生理功能物质的重要组成部分。人体吸收矿物质离子的主要部位是在大肠中的结肠部分。 Coudray[50]和 Van den Heuve[51]的研究发现，在日常膳食中添加益生菌和益生原，可以显著提高志愿者体内钙离子的吸收。其机理可能是由于益生菌或者益生原的摄入增加了肠绒毛的长度以及隐窝的深度，进而增加了矿物质离子的吸收面积，因此钙离子得以更好的吸收。

2益生菌Lactobacillus casei Zhang 对人肠道菌群的影响

Lactobacillus casei Zhang 是自主分离、筛选自内蒙古地区传统发酵酸马奶中 1 株性能优异的益生菌[52-53]，具有较强耐人工胃液[54]、胆盐消化[55]、免疫调节[56]、抗氧化[57]等益生功能。目前，对该菌株已完成了全基因组序列测定、蛋白组学和转录组学分析研究，不仅从“组学”水平解析了该菌株耐酸、耐胆盐等益生特性相关的机理，而且从基因组层面发现不含有耐药性和治病相关的基因，从而也佐证了该菌株的安全性[58-59]。

2010 年，本实验共征集 24 名健康志愿者，分为 3 组，青年组（Y 组，10 人，男女各 5 人），年龄23～26 岁，平均年龄 24.5 岁；中年组（M 组，7 人，男性 3 人，女性 4 人），年龄 34～39 岁，平均年龄38.4；老年组（E 组，7 人，男性 4 人，女性 3 人），年龄 62～68 岁，平均年龄 65.2 岁。总男女比例 1∶1。每个志愿者每天饭后咀食 Lactobacillus casei Zhang 片剂 4 粒，每粒含 Lactobacillus casei Zhang活菌 1×1010CFU。连续服用 28 d，分别在 0、14、28d，以及停止服用后 7 d（连续 35 d）、14 d（连续 42d）采集志愿者粪便样品。从宏基因组的角度出发，采用 RT-PCR 和焦磷酸测序技术相结合的方法，系统分析 24 名志愿者服用益生菌Lactobacillus casei Zhang 片剂后不同时期该菌株在肠道内的定植情况。着重分析益生菌干预后肠道微生物中优势菌群的变化情况，评价该菌株在人体中改善肠道菌群的实际功效，进而综合解析益生菌益生机理机制。

2.1口服Lactobacillus casei Zhang 在人肠道中的存活情况

应用 RT-PCR 技术定量研究不同时期各个志愿者粪便中 Lactobacilluscasei Zhang 的数量，结果见图 1。当服用 Lactobacillus casei Zhang 14 d后，粪便中该菌平均达到（8.41±0.68）Log10CFU/g（即 108.41CFU/g）；到 28 d 时，志愿者粪便中 Lacto-bacillus casei Zhang 平均含量为（8.55±0.57）Log10CFU/g（即 108.55CFU/g）。对于不同年龄的人，青年人群粪便中的活菌数＞中年人群＞老年人群。当停止口服给予 Lactobacillus casei Zhang 7d 时，粪便中活菌下降到105.86CFU/g；到 14 d 时，活菌下降到 105.52CFU/g，下降幅度不大。这一结果间接地说明了 Lactobacillus casei Zhang 可以在人肠道中定植和繁殖。对于不同年龄的人，停止给予 Lacto-bacillus casei Zhang 时，老年人群粪便中存留的活菌数＞中年人群＞青年人群。

2.2

益生菌 Lactobacillus casei Zhang 对肠道微生物构成的影响———焦磷酸测序结果如图 2 所示， OTU 显著性分析结果表明服用益生菌 Lactobacillus caseiZhang 前，青年组与老年组肠道微生物构成差异显著（p<0.05），而两者与中年组差异均不显著。服用 28 d 及停服 14 d 后三者差异均不显著。这说明服用益生菌 Lacto-bacillus casei Zhang 对受试者肠道微生物丰度产生了影响。

由图3可知，未服用Lactobacillus casei Zhang 时，中年组受试者肠道微生物构成分布相对集中，而老年组离散程度最大，青年组次之。这说明中年组受试者肠道微生物构成个体差异较小，而老年组差异最大，青年组次之。服用 Lacto-bacillus casei Zhang 28 d 及停服后 14 d 时，受试者肠道微生物构成在主成分图上分布位置较之服用前整体偏向右下方。这可能是由于服用益生菌后肠道中酸杆菌门（Acidobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）、螺旋菌门（Spirochaete）和疣微菌门（Verrucomicrobia）明显下降所致。在服用 Lactobacillus caseiZhang 后，3 组受试者在主成分图上偏向左下方的趋势是青年组大于中年组，而老年组变化趋势不明显。这说明服用益生菌Lactobacillus casei Zhang 对青年人肠道微生物构成的影响要大于中、老年人。服用 Lactobacilluscasei Zhang 28 d 时和停服 14 d 后，受试者在主成分图上的位置变化不明显。这说明口服益生菌Lactobacillus casei Zhang 对肠道微生物构成的影响是持续性的，同时也间接说明益生菌 Lacto-bacillus casei Zhang 可能在肠道中定植。

由上述试验结果可以看出，Lactobacillus ca-sei Zhang可以定植于人体肠道，改善肠道菌群结构，影响肠道微生物丰度，提高短链脂肪酸代谢水平，抑制次级胆汁酸形成，并对受试者肠道微生物带来积极、持续的影响。

3 存在的科学问题和发展方向

3.1 科学问题

虽然益生菌和肠道菌群关系的研究课题逐年增多，研究广度逐年拓宽，研究深度逐浙加深，但是仍有一些瓶颈问题亟待解决。

3.1.1肠道菌群影响因素复杂

人未出生前一直是在一个无菌的环境中，肠道菌群显然是后天获得的。肠道菌群构成复杂，而影响肠道菌群的因素更是种类繁多。在众多的影响因素中饮食习惯起主导作用。 De Filippo 等[27]的研究表明，饮食习惯和环境差异均对肠道菌群的组成有较大影响。Dethlefsen 等[28]的研究表明抗生素可以导致人肠道中定居细菌的长期改变，因此抗生素的干扰也是不可忽略的。除了饮食习惯和抗生素的干扰外，遗传因素、健康状况甚至吸烟与否都会对肠道菌群带来影响，因此，在评估某种益生菌对肠道菌群的影响时，是否需要将这些因素考虑进去，怎样尽可能地排除这些因素的干扰，成为研究人员争论的焦点。

3.1.2益生菌影响肠道菌群的作用机理尚未清晰

目前关于益生菌对肠道菌群影响的研究还大多停留在现象的揭示，这类研究大多描述了摄入某种益生菌后肠道微生物产生的各种应激反应及改变，但是很少有研究去解释这种现象发生的原因和机理。为什么摄入益生菌会影响肠道菌群的结构，这个问题值得研究人员深入探讨。

3.2发展方向

3.2.1益生菌作用机理研究仍是核心   分子生物学的发展使得在分子水平上研究益生菌对肠道菌群的作用机理成为可能，也将该领域的研究推向一个更高的层次。通过研究消化道内菌体细胞的代谢水平，宿主对菌体细胞生产的功能性成分的利用，微生物菌群对宿主个器官的影响以及菌群之间的相互作用机制，真正弄清楚益生菌在影响肠道菌群时所扮演的“角色”。

3.2.2 引进前沿分子生物学手段  第 2 代测序仪Recho454———焦磷酸测序平台（Pyrosequencing）的出现为全面、快速、准确地研究微生态环境中微生物多样性提供了新的方法。在焦磷酸测序前为每个样品加上一段8～10个被称作样品特异性条形码（barcode）或者标签（Tag）的核苷酸序列，这样就可以实现高通量、多样本的平行试验。这种方法被称为多重条形码焦磷酸测序技术（MultiplexBarcoded Pyrosequencing）。该方法可以一次分析多个样本，大大节约了试验成本，提高了试验效率，并且可以实现不同样本间的关联分析。 2010年，本实验室工作人员首次将这一前沿技术应用到益生菌对肠道菌群影响的研究中，对服用益生菌 Lactobacillus casei Zhang 不同时期志愿者的肠道微生物菌群进行焦磷酸测序，全面、客观地揭示该菌株干预下机体菌群的改变。

 

 

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