摘要: 为研究干酪乳杆菌 Lb casei Zhang 细胞壁肽聚糖 ( peptidoglycan; PG) 的抗肿瘤作用, 用流式细胞仪检测肽聚糖对人胃癌 BGC-823 细胞生长周期的影响。以肝癌 H22细胞移植瘤昆明小鼠为模型, 分别采用原位杂交和免疫组化方法检测小鼠移植瘤增殖细胞核抗原 ( PCNA) mRNA 的表达以及凋亡因子 Bc-l 2 和 Bax 基因的蛋白表达。

结果显示, 肽聚糖能够阻滞人胃癌 BGC-823细胞生长于 G0/G1 期; 实验组 PCNA mRNA 的表达和 Bc-l 2 基因的蛋白表达平均光密度值均明显低于对照组, 而 Bax 基因蛋白表达情况则相反, 与对照组比较, 均差异显著 (=0 05), 且抑瘤率达 37 21%。提示干酪乳杆菌 Lb casei Zhang 细胞壁肽聚糖具有抗肿瘤作用。

关键词: 肽聚糖; Lb  casei  Zhang; 抗肿瘤

中图分类号: S853  2 文献标识码: A  文章编号: 1671-8151 (2008) 03-0353-04

 

Studies on Ant-i tumor effects ofpeptidoglycan derived from Lb casei Zhang in vivo and in vitro

WEN Xiao-qing et al.

(K ey laboratory of Dairy Biotechnology andEngineering, Ministry of Education PRC, I nner Mongolia Agricul-turalUniversity , H uhhot 010018, China)

Abstract: To study effect of peptidoglycan( PG) of Lb casei  Zhang cell wallagainst tumor , the cell cycles were ana-lyzed in human gastric cancer BGC-823cells using flow cytometry. The positive expression of the proliferating cellnu-clear antigen (PCNA) mRNA、Bc-l 2 and bax oncoprotein were investigated in mousetransplantation tumors by in si-tu hybridization and immunohistochemistrytechnique, depending on the animal model of Kunming mouse transplanta-tiontumors of hepatoma H22. T he results showed that: peptidoglycan could cause theG0/G1 phase block of BGC-823cells. T he mean optical density of PCNA mRNA andBc-l 2 oncoprotein in peptidoglycan group were significantly lowerthan those inthe control group. The mean optical density of Bax was contrary to that of Bc-l2 oncoprotein. Compared with control group, the differences were allsignificant. The tumor inhibiting ratio of peptidoglycan was 37 21%.The goodeffect of peptidoglycan of Lb?casei?Zhang cell wall in vivo and invitroindicated that it had ant-i tumor activ-ity.

Key words: Peptidoglycan; Lactobacilluscasei Zhang; Ant-i tumor

 

乳酸菌是一类能发酵碳水化合物的革兰氏阳性细菌的通称, 是人体肠道内重要的生理菌群之一。近年来, 关于乳酸菌抗肿瘤的研究层出不穷,但其详细机制还未得到深入研究。有研究表明,乳酸杆菌可以抵抗亚硝基胍的致结肠癌作用, 增强机体免疫监视功能[ 1, 2]。肽聚糖 ( peptidogly-can; PG) 是乳杆菌细胞壁的主要组成成分。SunJ[3]等人研究发现, 乳酸杆菌肽聚糖能够通过激活巨噬细胞, 引起机体免疫应答来发挥抗肿瘤作用。Lb?casei?Zhang 由本实验室分离自内蒙古传统发酵乳- 酸马奶中, 具有优良益生特性[ 4]。该菌株通过体外耐酸性实验、人工胃肠消化液耐受性分析、胆盐耐受性以及体外降胆固醇作用等实验分析筛选而得[ 5], 具有抗氧化作用, 并对小鼠外周血 T 淋巴细胞亚群及血清 IgG和肠粘膜 SI-gA 具有显著的有益影响[ 6], 其种属归类已通过16SrDNA 同源性分析, 与标准菌株 GenBank 中Lb casei AT CC 334 的同源性为 100%[ 7]。

本文从干酪乳杆菌 Lb caseiZhang 细胞壁中分离得到肽聚糖; 体外培养条件下, 利用流式细胞仪检测肽聚糖对胃癌 BGC-823 细胞生长周期的影响; 在体内实验中, 采用原位杂交、免疫组化等方法, 研究肽聚糖对肝癌 H 22细胞移植瘤的抵抗作用, 并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1 1菌种

干酪乳杆菌 Lb casei Zhang

1 2肽聚糖的提取

参照文献[ 8], 提取出的肽聚糖用无菌 PBS 缓冲液配制成浓度为 2mg mL- 1的溶液, - 80 ?

保存备用。

1 3 细胞株

人胃腺癌 BGC-823 细胞株, 小鼠腹水型肝癌H 22细胞株, 均由内蒙古医学院惠赠。

1 4实验动物

清洁级昆明系小白鼠, 6~ 8 周龄, 体重 18~22 g, 雌雄各半, 由内蒙古大学国家标准清洁级

实验动物繁殖中心提供。

1 5主要试剂

细胞培养液 RPMI-1640 ( Cat No 31800-022) : 美国 GIBCO 公司产品; 类标准胎牛血清 (Cat# TBD31HB) : 天津市灏洋生物制品科技责任有限公司; 兔抗 Bc-l 2 抗体、Bax 抗体及即用型 SABC 免疫组化试剂盒 ( 编号: SA-1022) 、PCNA ( 增殖细胞核抗原) 原位杂交试剂盒 ( 编号: MK1126) 均由武汉博士德公司提供; DAB酶底物显色试剂盒: 美国 MBI 公司; 四色流式细胞仪: FACScan 型美国 BD 公司; 其它试剂均为进口分析纯。

1 6体外实验肽聚糖对 BGC-823 细胞生长周期的影响

取同步培养形成单层的对数生长期 BGC-823细胞 4 瓶, 其中 3 瓶分别加入肽聚糖剂量为 0 5mg、0 25 mg、0 1 mg, 作为肽聚糖高、中、低剂量组, 另外一瓶加入无菌 PBS, 作为对照组。继续培养 48 h 后, 用0 25% 胰蛋白酶消化细胞成单细胞悬液, 0 01 mol/ L、pH7 4 的 PBS 洗涤 2次, 以除去悬液中细胞碎片, 70% 冷乙醇固定,碘化丙啶 ( PI) 染液4 染色 30 min, 400 目筛网过滤, 进行流式细胞仪分析细胞周期。每个数值为 104个细胞的测定值。

1 7体内实验

1 7 1 实验分组及方法

以肝癌 H22细胞株制备小鼠腹水瘤模型,在无菌条件下, 取带瘤小鼠的腹水用无菌生理盐1 10 稀释, 于昆明种小鼠右前腋下以每鼠 0 2mL 瘤液接种, 每只小鼠接种细胞数为 6 10 6个。24 h 后将小鼠按雌雄对半随机分成 2 组, 每组 10 只, 设肽聚糖 ( PG) 组和 PBS 对照组。肽聚糖组小鼠每日 1 次腹腔注射肽聚糖 0 5 mL, PBS 对照组小鼠每日 1 次腹腔注射 PBS 0 5 mL,连续注射 15 d, 期间自由采食。停止注射后次日,断颈处死, 剥取瘤块称重, 按公式抑瘤率= ( 1一试验组平均瘤重/ PBS 对照组平均瘤重) 100% 计算抑瘤率, 并将瘤块制片, 做原位杂交和免疫组化实验。

1 7 2 PCNA ( 增殖细胞核抗原) 原位杂交实验PCNA 原位杂交实验操作程序按照试剂盒说

明书进行。

1 7 3 Bc-l 2 和 bax 免疫组化实验以 PBS 代替一抗作为阴性对照, 具体操作步骤参考试剂盒说明书。

1 8统计学处理

流式细胞仪检测结果采用Modfit 自动分析软件进行分析。原位杂交和免疫组化实验的每份瘤块标本的切片各随机选取两张, 在 400 倍视野下选取 5 个视野, 用计算机图像分析系统对所选视野进行图象采集, 并用 Moti Image Advaneed 3 0图像分析软件检测其阳性信号, 以平均光密度值反映PCNA、Bc-l 2、Bax 表达的强弱, 光密度值越高, PCNA、Bc-l 2 和 bax 的表达就越强。实验数据均以均数标准差 ( Mean SD) 表示, 应用 SAS 9 0统计软件对测量数据进行 anova/ dun-can 检验分析, 检验水准= 005。

2 结果与分析

2 1肽聚糖对 BGC-823细胞生长周期的影响

实验结果

表 1 表明, 在肽聚糖各剂量组中,BGC-823细胞 G0/ G1 期细胞百分比与对照组比较, 升高幅度较大, S 期和 G2/ M 期细胞百分比与对照组相比, 均有所下降, 但下降不是非常明显。其中,高剂量组显示较好的效果, 说明肽聚糖主要抑制肿瘤细胞从 G1 期向 S 期的转变, 从而使细胞生长阻滞于 G0/ G1 期。

    

2 2肽聚糖对 H 22移植瘤抑制作用结果注射肽聚糖后, H22移植瘤生长受到抑制,肽聚糖组肿瘤平均重量为 ( 2 75 0 13) g, 与PBS 对照组 ( 4?38?0?26) g 比较, 差异显著 (= 0 05) , 抑瘤率达到 37 21%。

2 3 肽聚糖对 PCNA mRNA 表达影响的结果见表 2 和图 1, 2。

 

表 2 表明, 肽聚糖组肿瘤组织 PCNA阳性表达平均光密度值 ( 0 124 0 006) 明显低于对照组 ( 0 215 0 035) , 两者之间比较差异显著 (= 0 05) 。从图1 和图 2可以看出, PCNA 阳性细胞浆呈棕黄色, 背景清晰, 对照组 PCNA 阳性细胞数明显多于肽聚糖组。说明肽聚糖能够影响PCNA 表达, 使细胞增殖受到影响。

表 3 表明, 肽聚糖组和 PBS 对照组的 Bc-l 2表达平均光密度值分别为 ( 0 112 0 008) 和 ( 0 202 0 012), 两者之间比较差异显著, Bax 平均光密度值分别为( 0 291 0 015) 和( 0 162 = 0 009) , 且差异也有显著性。Bc-l 2 和 Bax 基因的蛋白阳性表达产物均位于胞浆, 尤其在核周更明显。肽聚糖组 Bc-l 2 阳性细胞数明显少于 PBS 对照组, 而 Bax 阳性细胞数明显多于 PBS 对照组( 见图 3、4、5、6) 。提示肽聚糖能够抑制 Bc-l 2 表达, 促进 Bax 表达, 从而促进肿瘤细胞凋亡的发生。

 

3 讨论

目前研究发现, 肽聚糖是一种无毒副作用的生物反应调节剂, 在体内外均能显示出抗肿瘤、免疫赋活等功能[ 9, 10]。许多抗肿瘤药物能够使肿瘤细胞周期阻滞于某一时期, 从而来抑制肿瘤细胞的增殖[ 11]。本研究体外实验结果发现, Lb casei Zhang 细胞壁肽聚糖能够使处于 G0/ G1期的 BGC-823 细胞百分比增加, 对 G2/ M 期和 S期细胞百分比影响不大, 且肽聚糖高剂量组效果明显。说明肽聚糖主要抑制肿瘤细胞从 G1 期向 S期的转变, 从而使细胞生长阻滞于 G0/ G1 期。G0/ G1 期是细胞 DNA 合成的前期。肽聚糖将肿瘤细胞生长阻滞于 G0/ G1 期, 使 DNA 合成受抑制, 阻止细胞进一步分裂, 进而发挥抗肿瘤作用。动物实验表明, Lb casei Zhang 细胞壁肽聚糖具有良好的体内抗肿瘤作用, 抑瘤率达37?21% 。肽聚糖组小鼠的肿瘤重量明显低于对照组, 且差异显著 (= 0 05) 。原位杂交实验结果发现, 肽聚糖对 PCNA mRNA 表达有明显抑制作用, 肽聚糖组 PCNA mRNA 阳性细胞平均光密度值明显低于对照组, 且差异显著 (= 005) 。PCNA 是 DNA 聚合酶的核心蛋白, 存在于细胞

核内, 由 261 个氨基酸组成, 表达于细胞的 G1期, S 期达到高峰, G2~ M 期下降, 其量的变化与 DNA 合成一致, 能反映细胞的增殖活性。PC-NA阳性细胞数可以反应细胞增殖的活跃程度[ 12]。处于增殖状态的细胞, 其PCNA 的表达明显增多。因此, 我们认为肽聚糖可能是通过抑制肿瘤细胞增殖来发挥抗肿瘤作用。

细胞凋亡可由不同信号途径启动并通过不同的生化途径执行 [ 13]。Bc-l 2 蛋白是目前了解比较公认的一种抑制细胞凋亡的重要因素。与 Bc-l 2功能密切相关的是 Bax ( Bc-l 2 associdted X pro-tein) , 它是一个凋亡促进基因。Bax与 Bc-l 2 可形成异二聚体, Bax 过度表达时细胞凋亡增多,而 Bc-l 2 过度表达时, 其产物可与 Bax 结合, 从而抑制了凋亡[ 14]。在本研究中, 荷瘤小鼠经过腹腔注射肽聚糖后, 其移植瘤组织 Bc-l 2 阳性细胞平均光密度值显著低于 PBS 对照组, 而 Bax 基因的表达则相反。提示肽聚糖能够作为凋亡信号使肝癌移植瘤细胞的 Bc-l 2 基因的表达下调, 同时使 Bax 基因的表达增强, 最终诱导肿瘤细胞凋亡。

通过本实验, 我们认为, Lb caseiZhang 细胞壁肽聚糖能够通过阻止癌细胞增殖, 并调控相关增殖基因和细胞凋亡基因的表达, 从而发挥抗肿瘤作用。

果实采后贮藏期间颜色的变化也是衡量果实品质与耐贮性的一个重要指标[ 8]。赵鑫[ 9]研究表明, CaC12 处理冬枣果实采后失水率和色差逐渐上升。据报道[ 10], 缺锰时, 叶片有褪色现象, 开花结果少, 果实着色不好, 品质差, 裂皮。本试验表明, 钙、锰、钙加锰处理均有助于增加果实的红色, 保持果皮亮度, 延缓底色变黄时间。其中锰和钙加锰处理效应最显著, 钙处理不明显。同时, 研究[ 11]还表明, 元帅苹果含糖量越高, 着色度也越高, 全糖由 9 64% 增至 14 78% , 着色度也相应由 23% 增至 58%。这也与本试验结果相符, 锰处理后桃果实的可溶性固形物含量明显高于对照及其他处理, 并且在对色泽的影响效应中,锰处理对果实表面红色的增加效应最显著。再次证实, 果实含糖量与果实的色泽有密切关系, 但锰处理对增加红色和含糖量的机理尚未清楚。

 

参考文献

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