【摘要】 目的  探讨受精后第四天胚胎不同形态学评分对于IVF-ET临床妊娠结局的预测价值。方法  回顾性分析于2018年2月至2019年2月在我院生殖中心行IVF-ET的282例患者临床数据。纳入标准：首次试管助孕，女方年龄≤35，新鲜第四天移植。排除标准了子宫内膜异位、盆腔炎等宫腔和盆腔病变，子宫畸形和如染色体多态的染色体异常患者。若受精后第三天优质胚胎数量≥4个，则受精后第五天选择囊胚移植；若可用胚胎数量多于移植个数且未达到第五天囊胚移植标准，则受精后第四天选择早期囊胚或桑葚胚移植。其中移植胚胎中包含卵裂胚胎只有2例，样本量太少未计入分组。将移植胚胎数为2，且形态学评分相同的患者分为部分融合胚组、完全融合胚组和初期囊胚组三组。比较三组的女方年龄、体质量指数、不孕年限、基础FSH水平和移植日子宫内膜厚度、D3天可用胚胎数和D3优质胚胎数等一般资料，并比较三组种植率和临床妊娠率有无差异。将第四天移植胚胎中含有一枚卵裂胚胎、部分融合、初期囊胚和完全融合计为1分、2分、3分和4分。评分之和即为本移植周期的胚胎累计评分，将女方年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH、移植日内膜厚度、移植胚胎数和移植胚胎累计评分与第四天移植临床妊娠的相关性进行多因素Logistics回归分析。结果  部分融合胚组、完全融合胚组和初期囊胚组移植日子宫内膜厚度没有显著差异；种植率为41.46(34/82)、60.34(70/116)和 56.08(83/148)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；临床妊娠率分别为53.66(22/41)、81.03(47/58)和75.68(56/74)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素Logistics相关分结果显示，女方年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH、移植日内膜厚度和移植胚胎数与第四天移植临床妊娠的相关性没有统计学意义(P>0.05)。第四天移植临床妊娠随累计评分的增加显著升高，具有显著的统计学相关性((OR1.25，95%CI 1.02-1.54，P 0.030)。结论 受精后第四天胚胎形态学评分可分为卵裂胚、部分融合胚、完全融合胚和初期囊胚，优先选择完全融合胚依次为初期囊胚移值，相对于部分融合和卵裂胚可显著提高临床妊娠结局。 


【关键词】 胚胎评分；桑椹胚；胚胎移植；妊娠结局


随着辅助生殖技术的发展，胚胎培养系统越来越稳定，延长体外培养时间以获得最有发育潜能胚胎移入子宫，减少移植次数和缩短助孕周期，以次减轻不育家庭负担和获得最佳患者满意度，获得解决不孕夫妇生育问题成为辅助生殖领域的热门话题。多数研究报道，D3移植卵裂胚可能遭遇胚胎基因组未激活和异常受精等风险[1-2]。相对于卵裂胚移植，囊胚移植在临床妊娠率和种植率上均具有明显的优势，且具有更低流产率[3]。然而胚胎在体外培养过程中不可避免的遇到培养微环境的波动，这些波动如PH，温度、渗透压的改变据有可能对胚胎发育造成影响[4-5]，导致D5未能获得可移植囊胚，移植周期取消，或者种植后胚胎发育停滞等影响。有报道指出桑椹胚与囊胚具有相似的优势，因为它们具有激活的胚胎基因组，且与D2、D3的卵裂期胚胎相比，它们与子宫内膜环境有更好的同步性[6-7]。然而，受精后第四天移植并没有广泛应用，规范的助孕方案也为形成。因此，针对受精后第四天胚胎的形态学评分，我们通过比较卵裂胚、部分融合、完全融合和初期囊胚移植后临床妊娠结局情况。期望能够对第四天胚胎移植结局的预测带来帮助，为新鲜周期第四天移植胚胎评分提供一定的理论依据。


材料与方法


一、研究对象

1．回顾性分析于2018年1月至2019年2月在我院生殖中心行IVF-ET的282例患者临床数据。根据受精后第三天胚胎发育情况选择性受精后D3/D4/D5移植1-2 枚胚胎。若受精后第三天优质胚胎数量≥4个，则受精后第五天选择囊胚移植；若可用胚胎数量多于移植个数且未达到第五天囊胚移植标准，则受精后第四天选择早期囊胚或桑葚胚移植。

2.纳入标准：年龄小于等于35 岁，首次因女方因素输卵管因素和卵巢高反应或男方因素接受辅助生殖助孕行常规长方案IVF或ICSI受精首次试管助孕，新鲜第四天移植。

3.排除标准：子宫内膜异位、盆腔炎等宫腔和盆腔病变，子宫畸形和如染色体多态的染色体异常患者。


二、研究方法

1.控制性促排卵：纳入研究对象均采用常规长方案超促排卵，女方在黄体期肌注促性腺激素释放激素类似物（GnRHa）（达菲林，Ipsen Pharma Biotech，法国），达到降调节目的后，给予重组促卵泡β素（普利康，Meck Sharp＆Dohme Limited，英国）或尿促性素（乐宝得，丽珠制药，珠海）促排卵，定期通过阴道B超监测卵泡发育情况，当1/3卵泡直径≥1.8 cm时肌肉注射绒毛膜促性腺激素（立柱制药，珠海）5000～1000U，36.5 h左右B超引导下经阴道穿刺取卵，卵冠丘复合体置于37℃，6 %CO2培养箱中培养。


2. 体外受精和胚胎移植：授精方式分为IVF和ICSI两种，取卵后 3～4 h 体外授精。IVF：授精密度为 2万条每个卵母细胞，授精后4～6 h拆除卵子周围颗粒细胞，观察受惊情况酌情行早补救ICSI。ICSI：取卵后4～6 h选择成熟卵子进行卵胞浆内显微注射。根据受精后第3天胚胎的形态学评分，在受精后第3天，根据卵裂球数目、大小和碎片等情况进行形态学评分:Ⅰ级为卵裂球大小均匀，形态规则，胞质均匀清晰，无碎片或＜10%；Ⅱ级为卵裂球大小均匀或略不均匀，形态欠规则，无碎片或10 %～20 %；Ⅲ级为卵裂球大小不均，形态欠规则，碎片20 %～50 %；Ⅳ级为卵裂球大小严重不均，碎片＞50%。级别在Ⅲ级及以上的胚胎为可移植用胚，Ⅱ级及以上为优质胚胎。根据受精后第三天胚胎发育情况选择性受精后D3/D4/D5移植1-2 枚胚胎。


3.黄体支持和妊娠确定:取卵当日即肌注黄体酮注射液（浙江仙琚）进行黄体支持。视HCG注射日E2水平，移植日给予适量雌二醇（补佳乐，拜耳医药，德国）补充，移植当日常规使用黄体酮（安琪坦，博赏医药，法国）口服或阴道上药进行黄体支持。移植后14 d查血HCG确定生化妊娠，移植后28 d B超检查，见孕囊确定临床妊娠。


三、统计学分析

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析，定量资料采用0.png表示，组间比较用独立样本t检验；计数资料用百分比表示，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有显著性。


结果


一、一般资料比较

选取2018年2月至2019年2月在我院生殖中心行IVF-ET共282例患者临床数据，其中移植胚胎中包含卵裂胚胎只有2例，样本量太少未计入分组。将移植胚胎数为2，且形态学评分相同的患者分为部分融合胚组（41例）、完全融合胚组（58例）和初期囊胚组（74）三组。三组在年龄、体质量指数、不孕年限、基础FSH水平和移植日子宫内膜厚度和D3优质胚胎数无显著性差异（P＞0.05）；D3可移植胚胎数部分融合胚组、完全融合胚组和初期囊胚组分别为5.61±1.87、6.64±2.22和8.32±3.36，差异具有显著的统计学意义（P<0.05）(表1)。

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二、各组间第四天移植临床妊娠结局的比较

部分融合胚组、完全融合胚组和初期囊胚组移植日子宫内膜厚度没有显著差异；种植率为41.46(34/82)、60.34(70/116)和 56.08(83/148)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；临床妊娠率分别为53.66(22/41)、81.03(47/58)和75.68(56/74)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2）。


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三、相关因素与第四天移植临床妊娠的回归分析

为验证第四天形态学评分完全融合胚胎>初期囊胚>部分融合>卵裂胚胎，将第四天移植胚胎中含有一枚卵裂胚胎、部分融合、初期囊胚和完全融合计为1分、2分、3分和4分。评分之和即为本移植周期的胚胎累计评分。多因素Logistics相关分结果显示，女方年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH、移植日内膜厚度和移植胚胎数与第四天移植临床妊娠的相关性没有统计学意义(P>0.05)。第四天移植临床妊娠随累计评分的增加显著升高，具有显著的统计学相关性((OR1.25，95%CI 1.02-1.54，P 0.030)。


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讨论


随着辅助生殖技术的发展，胚胎培养系统越来越稳定，延长体外培养时间以获得最有发育潜能胚胎移入子宫，减少移植次数和缩短助孕周期，以次减轻不育家庭负担和获得最佳患者满意度，获得解决不孕夫妇生育问题成为辅助生殖领域的热门话题。由于多种原因，核逆转、多核、逆乱裂和异常卵裂模式的存在，定时定点的形态学观察并不能有效的反应胚胎的发育情况[8-9]，即使D3的优质胚胎也没有一个满意的种植率。多数中心通过延长培养时间的方法优选最具发育潜能的胚胎，同时大量研究表明，囊胚移植具有较高的种植率[10-11]。然而，培养养囊胚具有较高的移植取消率[12]；同时，囊胚期胚胎移植同卵双胞胎发生率也明显升高，成为孕妇多胎妊娠的危险因素[13]。


有报道指出桑椹胚与囊胚具有相似的优势，因为它们具有激活的胚胎基因组，且与D2、D3的卵裂期胚胎相比，它们与子宫内膜环境有更好的同步性[6-7]。我们主要比较了受精后第四天不同形态学评分与临床妊娠的关系。


正常人类胚胎受精后第四天胚胎发育为桑椹胚阶段，但实际工作中我们发现受精后第四天可出现卵裂期胚胎，桑椹胚和初期囊胚[14]。根据桑椹胚融合程度将胚胎分为部分融合胚和完全融合胚。因此，我们建议将第四天胚胎分为卵裂胚，部分融合胚、完全融合胚和初期囊胚。

有研究表明胚胎发育迟缓严重影响种植成功率，同时过快的胚胎发育也可能影响移植胚胎临床妊娠结局[15]。这与我们的研究结果相似，分融合胚组、完全融合胚组和初期囊胚组移植日子宫内膜厚度没有显著差异；种植率为41.46(34/82)、60.34(70/116)和 56.08(83/148)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）；临床妊娠率分别为53.66(22/41)、81.03(47/58)和75.68(56/74)，其中完全融合胚组显著高于其他两组，差异有统计学意义（P＜0.05）。多因素Logistics相关分结果显示，女方年龄、不孕年限、体质量指数、基础FSH、移植日内膜厚度和移植胚胎数与第四天移植临床妊娠的相关性没有统计学意义(P>0.05)。第四天移植临床妊娠随累计评分的增加显著升高，具有显著的统计学相关性((OR1.25，95%CI 1.02-1.54，P 0.030)。


综上所述，受精后第四天胚胎形态学评分可分为卵裂胚、部分融合胚、完全融合胚和初期囊胚，优先选择完全融合胚依次为初期囊胚移值，相对于部分融合和卵裂胚可显著提高临床妊娠结局。若需挑选两枚胚胎移植，可行完全融合胚和初期囊胚各一枚移植，规避分险。本研究样本量较小，有待大样本量持续验证，希望为了获得更好的IVF-ET临床结局提供参考。


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[4]Morbeck DE. Air quality in the assisted reproduction laboratory: amini-review[J].J Assist Reprod Genet,2015,32(7):1019-1024. 

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耿亚松简介

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邢台不孕不育专科医院（邢台生殖与遗传专科医院）生殖实验室技术员，毕业于河北医科大学，硕士研究生。邢台不孕不育专科医院生殖实验室工作，研究方向不孕课题。