【摘 要】 目的 研究精液优选前后精子DNA碎片的变化情况。方法 采用配对设计研究，对2018年1月至2018年12月期间就诊于我院的不育患者56例，采集精液标本，对同一份精液标本经密度梯度离心法优选前后均通过CASA行常规精液分析，通过精子染色体扩散试验（SCD法）行精子DNA碎片率检测，采用配对t检验对比优选前后精子DNA碎片率及各项精液参数的变化。 结果 精液优选后前向运动精子（PR）提高（53.23±11.52）%，精子DNA碎片率降低（8.58±6.02）%，差异均有统计学意义（P<0.001）； 结论 精液优选技术-密度梯度离心法可明显改善优选后精子常规参数，对于去除DNA损伤的精子是安全有效的。


【关键词】  精子优选；配对t检验；精子DFI；精子DNA碎片


男方精子质量是正常受精、胚胎发育的基础。精子DFI是较精液常规参数更为有效的评价精子质量、预测妊娠结局的男性不育指标[1-2]。本研究旨在研究精子优选在改善精子DNA碎片率方面的作用。


资料与方法


收集2018年1月至2018年12月就诊于邢台不孕不育专科医院的男性不育患者56例，所有患者排除罹患严重全身性疾病、躯体疾病、染色体异常、生殖泌尿系急性感染，正在进行或3个月内行药物治疗的患者。


取精前禁欲2-7d，精液液化后涂片，通过伟力计算机辅助精液分析 (CASA)系统，严格参照WHO《人类精液检查与处理实验室手册》第5版标准执行，分别记录精液量、PH、精子浓度、前向运动精子（PR），非前向运动精子（NP），不动精子（IM）等各项参数。精子DNA碎片检测：精液液化后取10μL涂片，选用安徽安科生物工程（集团）股份有限公司生产的试剂盒，对500条精子进行精子染色质扩散试验（SCD法），精子DNA碎片指数（DFI）=（小晕环精子+无晕环精子+退化的精子）/500×100%。


待精液标本液化，取少量原精液行精液分析和精子DNA碎片检测，记录为优选前数据；剩余精液经密度梯度离心后，取处理后的精子悬液再次行精液分析和精子DNA碎片检测，记录为优选后数据。


数据采用SPSS17.0软件进行处理，计量资料所有数据均行正态性和方差齐性检验，符合的数据采用均值±标准差（）表示；配对数据采用配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。


结 果


精液优选前后精子各项参数的比较。


将56例患者精液优选后前向运动精子（PR）提高（53.23±11.52）%，精子DNA碎片率降低（8.58±6.02）%，差异均有统计学意义（P<0.001），差异具有统计学意义（P<0.001）。


讨  论


人类精子DNA是人类遗传信息的载体，精子DNA的完整性是遗传物质正确传递给子代的前提。精子DNA损伤是多因素联合作用的结果，归纳其主要机制为：1.生精过程中的细胞凋亡[3]。2.精子运输过程中氧自由基的影响[4]。3.精子染色质包装异常[5]。


精子的凋亡是细胞的程序性死亡，是精子发生成熟过程中重要的特征之一，对维持精子的正常数量、正常功能、保护遗传物质稳定具有很大意义[6-7]。在男性不育中影响睾丸及附属性腺内外环境的因素会导致精子的凋亡增加，精子过多的凋亡会导致精子数量、活力、正常形态的降低，破坏精子DNA的完整性，并且严重影响精子功能[8]。本研究选用密度梯度离心法（DGC）优选精子，根据不同浓度的梯度液具有不同的密度，离心后可以将精液中细胞成分按密度不同进行分离，其目的是减少和去除精浆、死精子，获取足够数量的高质量、高活力的精子悬液[9]。通过该方法优选精子后发现：前向运动精子提高（53.23±11.52）%（P<0.001），精子DNA碎片率降低（8.58±6.02）%（P<0.001），效果明显。与本研究结果相一致，通过密度梯度离心法回收精子，国内研究者[10-12]观察到回收的总活动精子数、前向运动(a+b)精子明显提高，同时精子优选可以提高精子DNA的完整性。这个结论也得到了Ricci[13]等的证实，精液优选可以去除部分精子核DNA （nDNA）损伤的精子。精液优选必须去除精浆，精浆中的抗氧化物可以保护遗传物质免遭氧化损伤[14]，精液优选技术去除精浆的同时，不适当的精液优选处理可能激活ROS级联反应，引起精子DNA损伤[15]。本研究优选后发现精子常规参数，精子DNA碎片均明显降低，采用低离心力的密度梯度离心法基本上是安全有效的方法。


参考文献
[1]中华医学会男科学分会.男性生殖遗传学检查专家共识.中华男科学杂志,2015,21(12): 1138-1142．
[2]Li HY，Zhang H，Miao GY，et al． Simulated microgravity condi-tions and carbon ion irradiation induce spermatogenic cell apopto-sis and sperm DNA damage． Biomed Environ Sci，2013，26(9): 726-734.
 [3]Muratori M，Tamburrino L，Marchiani S，et al． Investiga-tion on the Origin of Sperm D NA Fragmentation: Role of Ap-optosis，Immaturity and Oxidative Stress［J］．Mol Med，2015，21: 109 －122.
[4]Lu C，Xu M，Wang R，et al． A genome-wide association study of mitochondrial DNA in Chinese men identifies two risk single nucleotide substitutions for idiopathic oligoasthenospermia． Mito-chondrion，2015，24: 87-92.
 [5]陆金春.精子 DNA 损伤的相关因素研究进展.中华男科学杂志，2015，21(8): 675-680.
 [6]Askari H, Rajani SF, Poorebrahim M, et al. A glance at the ther-apeutic potential of irisin against diseases involving inflammationoxidative stress , and apoptosis : An introductory review [J]. Phar-macol Res. 2018. 129: 44-55.
[7]Guan Y. Martin GB.Cellular and molecular responses of adult testis to changes in nutrition : novel insights from the sheep model J. Reproduction, 2017, 154(5): R133 -R141.
 [8]Potter SJ. De Falco T. Role of the testis interstitial compartment inpermatogonial stem cell function[J]. Reproduction, 2017, 153(4): R151-R162.
 [9]中华人民共和国卫生部.人类辅助生殖技术规范［M］.北京:中华人民共和国卫生部.
 [10]崔鑫，张宁等. 精液处理后精子染色质结构比例的改变对辅助生殖技术相关指标影响[J]中华男科学杂志, 2016，22(4): 379 －381.
[11]郑毅春，徐丽清，梁嘉颖，等. 优化处理技术对男性不育症患者精子形态和 DNA 碎片指数的影响［J］. 实用医学杂志，2017，33（2）：231⁃234.
[12]冯娜,陈欣洁. 精液优选对精子DNA碎片的影响及其对体外受精-胚胎移植妊娠结局的影响[J] 实用医学杂志，2017，33（17）：2885⁃2888.
 [13]Ricci G,Perticarari S,Boecolo R,et al.Semen preparation methods and sperm apoptosis: Swim-up versus gradient-density centrifuga-tion technique.Fertil Steril,2009,91(2);632-638.
[14] Qian MX，Pang Y,Liu CH,et al.Acetylation-mediated protea-somal degradation of core histones during DNA repair and sper-matogenesis.Cell，2013，153(5): 1012-1024．
[15]Agarwal A，Said TM．Oxidative stress，DNA damage and Apoptosis in male infertility：a clinical approach[J]．BJU Int，2005，95(4)：503—507．