刘魏1,2，张旭2，刘朝晖2*，罗新1

（1.暨南大学附属第一医院妇产科,广州 510630;2.北京大学第一医院妇产科）

【摘要】 目的：研究孵育时间、二相性、pH环境对白色假丝酵母菌药物敏感性的影响。方法：参照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的M27-A方案的微量液基稀释法，测量5种常用抗真菌药物抗102株白色假丝酵母菌的24h 、48h的最低抑菌浓度（MIC）及在pH7.0和pH4.0环境下特比奈芬抗60株白色假丝酵母菌孢子相和菌丝相的MIC值。结果：⑴pH7.0环境下的孢子相液基中，咪康唑、伊曲康唑、克霉唑、氟康唑和制霉菌素24h与48h的MIC值的基本符合率为91.2%～100%；⑵  5种抗真菌药敏符合率结果均达80%以上，伊曲康唑24h与48h的药敏符合率稍低，为81.4%，其他4种药物药敏符合率为96.1%～100%；⑶在pH7.0环境下，特比奈芬抗白色假丝酵母菌孢子相和菌丝相的MIC值差异无统计学意义（P=0.792），pH4.0环境下，孢子相液基的MIC值比菌丝相高，差异有统计学意义（P<0.001）；⑷无论孢子相亦或菌丝相液基，特比奈芬在pH4.0环境下的MIC值高于pH7.0环境，差异有统计学意义（P<0.001）。结论：孵育时间、二相性、pH环境对白色假丝酵母菌药物敏感性有影响。

 

 【关键词】 白色假丝酵母菌；孵育时间；二相性；pH；最低抑菌浓度

外阴阴道假丝酵母菌病（vulvovaginal candidiasis,VVC）是一种常见的妇科感染性疾病，其主要致病菌为白色假丝酵母菌（88.4%）[1]。假丝酵母菌是机会致病菌，具有二相性，即孢子和菌丝相，其致病状态主要为菌丝相。我们采用美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）推荐的M27-A微量液基稀释法，比较了咪康唑、伊曲康唑、克霉唑、氟康唑和制霉菌素抗白色假丝酵母菌的24h 与48h MIC值，并测定不同pH环境下特比奈芬对白色假丝酵母菌酵母相和菌丝相的最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration ,MIC），以研究白色假丝酵母菌在不同孵育时间、二相性及不同pH环境下对抗真菌药物的敏感性有无差异，以期为临床治疗提供理论依据。

1  材料和方法

1.1　材料

1.1.1  菌株  受试菌株共有104株，2株质控株，即近平滑假丝酵母菌(Candida parapsilosis)ATCC22019及克柔假丝酵母菌(Candida krusei)ATCC6258，102株白色假丝酵母菌(Candida albicans)，其中1株为ATCC96113，余下101株为临床株，来源于VVC病人的阴道分泌物，并经形态学和生化学鉴定。所有菌株均由北京大学第一医院微生态实验室提供。

1.1.2  抗真菌药物  6种抗真菌药物由中国药品生物制品检定所提供，为咪康唑、伊曲康唑、克霉唑、氟康唑、制霉菌素、特比奈芬。氟康唑用蒸馏水配制，质量浓度为1600μg/ml储存液，其余药物用100%二甲基亚砜配制为6400μg/ml和102400μg/ml储存液，于-20℃保存备用。

1.1.3　培养液  ⑴孢子相液基：1L溶液含RPMI 1640(Gibco )10.4g，吗啡啉丙磺酸(morpHolinepropanesulfonic acid，MOPS)(Amersco)34.5g(0.165mol/L)，用1mol/L NaOH及HCL调pH至7.0和4.0(25℃)，滤过灭菌，4℃备用；⑵菌丝相液基[2]：1L溶液中含RPMI1640 10.4g，20mmol/L HEPES，2mmol/L L-谷氨酰胺，2.5%加热灭活胎牛血清（水浴56℃，30min），2mmol/L葡萄糖，然后用NaHCO3及HCl调pH至7.0和4.0(25℃)，滤过灭菌，4℃备用；⑶沙堡弱葡萄糖琼脂培养基(SDA) (天津金章)。

1.2　方法

参照NCCLS M27-A方案，测定pH7.0的孢子相液基中咪康唑、伊曲康唑、克霉唑、氟康唑和制霉菌素抗102株白色假丝酵母菌的24h MIC值及48h MIC值，以及pH7.0和pH4.0环境下特比奈芬对其中60株咪康唑、克霉唑、氟康唑敏感株孢子相和菌丝相的MIC值。

1.2.1  抗真菌药液的制备  实验时将储存液解冻后分别用培养液进行倍比稀释，咪康唑、伊曲康唑、克霉唑、特比奈芬的系列质量浓度为16～0.03μg/ml；氟康唑、制霉菌素为64～0.125μg/ml，同时保证NCCLS M27-A方案要求的DMSO的最终接种浓度不超过1%。

1.2.2  结果判定  ⑴MIC终点判定：以80%受抑制为判定终点。参照如下判断标准：咪康唑MIC≤1μg/ml为敏感(susceptible, S)，2～4μg/ml为剂量依赖敏感(susceptible dose dependent, S-DD)，≥8μg/ml为耐药（resistant, R）；伊曲康唑MIC≤0.125μg/ml为S，0.2～0.5μg/ml为S-DD，≥1μg/ml为R；克霉唑MIC≤2μg/ml为S，≥4μg/ml为R；氟康唑MIC≤8μg/ml为S，16～32μg/ml为S-DD，≥64μg/ml为R；制霉菌素MIC≤4μg/ml为S，≥8μg/ml为R；、特比奈芬MIC≤0.5μg/ml为S，1μg/ml为S-DD，≥2μg/ml为R 。⑵基本符合率(essential agreement,EA)：24h与48h结果相差不超过2个浓度梯度的菌株数占受试菌株数的百分比；⑶药敏符合率（categorical agreement,CA）：24h与48h药敏程度相同的菌株数占受试菌株数的百分比。48h与24h差异的判定[3] ：小差异（minor errors）为24h判断为S而48h为SDD，及24h为SDD而48h为R；中差异（major errors,ME）为24h判断为R而48h判断为S；大差异（ very major errors,VME）为24h判断为S而48h判断为R。

1.2.3  质量控制  以近平滑假丝酵母菌ATCC22019和克柔假丝酵母菌ATCC6258为质控株进行质量控制。

1.3 统计学方法

用SPSS10.0版本软件进行Wilcoxon符号秩检验，24h与48h MIC值的关系行Pearson相关分析，各药物药敏情况分析用χ2检验。

2 结果

2.1 孵育时间对5种抗白色念珠菌MIC值的影响

各药物48h的MIC值均大于24h(P＜0.001)，各药物24h与48h MIC值的基本符合率均较高。见表1。各药物药敏情况符合率较好，伊曲康唑药敏符合率及敏感率均低于其他四种药物（P＜0.001）。见表2。

2.2 二相性、pH对特比奈芬抗白色念珠菌MIC值的影响

白色假丝酵母菌在不同pH环境下孢子相和菌丝相液基中35℃培养48h后可见，pH7.0和pH4.0环境下的菌丝相液基中均存在丰富的菌丝和假菌丝。见图1。pH7.0环境下特比奈芬抗60株白色假丝酵母菌孢子相和菌丝相的MIC值差异无统计学意义（P=0.792）。pH4.0环境下，孢子相液基的MIC值高于菌丝相液基，差异有统计学意义（P<0.001）。此外，pH7.0环境与pH4.0环境相比，无论孢子相还是菌丝相液基，后者的MIC值均较高，差异有统计学意义（P<0.001）。见表3。各环境下白色假丝酵母菌对特比奈芬的耐药率均很高，范围为66.7%～100%。见表4。

表1  5种药物抗102株白色假丝酵母菌的24h和48h MIC值

药物

时间（h）

MIC（μg/ml）

Z

P

R(Pearson)

基本符合率

（%）

几何均数

范围

咪康唑

24

0.02319

0.0075～ 0.50

48

0.04582

0.0150～ 1.00

7.890

P＜0.001

0.923

 99.0

伊曲康唑

24

0.08871

0.0075～ 1.00

48

0.14053

0.0300～ 1.00

6.177

P＜0.001

0.436

100.0

克霉唑

24

0.01856

0.0075～ 0.06

48

0.03042

0.0300～ 0.06

7.652

P＜0.001

-0.017

100.0

氟康唑

24

0.22051

0.0150～32.00

48

0.45754

0.1250～64.00

6.757

P＜0.001

0.643

 91.2

制霉菌素

24

1.48311

0.2500～ 8.00

　

48

2.08323

0.5000～ 8.00

6.177

P＜0.001

0.734

100.0

表2  102株白色假丝酵母菌24h、48h的药敏情况

药物

时间（h）

102株白念药敏情况

48h与24h差异

48h与24h药敏符合率（不符合个数）

S（%）

S-DD（%）

R（%）

小差异

中差异

大差异

咪康唑

24

100.0

0.0

0.0

48

100.0

0.0

0.0

0.0

0

0

100.0（0）

 伊曲康唑*

24

70.6

28.4

1.0

48

54.9

41.2

3.9

18.6

0

0

 81.4（19）

克霉唑

24

100.0

0.0

0.0

48

100.0

0.0

0.0

0.0

0

0

100.0（0）

氟康唑

24

99.0

1.0

0.0

48

96.1

2.0

2.0

2.9

0

1

96.1（4）

制霉菌素

24

99.0

0.0

1.0

48

98.0

0.0

2.0

0.0

0

1

99.0（1）

*经χ2检验，白色假丝酵母菌对伊曲康唑的敏感率在24h及48h皆低于其他4种药，P＜0.001

pH7.0孢子相液基中的孢子（ 40×）

pH7.0菌丝相液基中的菌丝及假菌丝（40×）

pH4.0孢子相液基中的孢子（100×）

pH4.0菌丝相液基中的菌丝（100×）

图1 白色假丝酵母菌在两种液基中的生长情况

表3 特比奈芬对60株白色假丝酵母菌的MIC值（μg/ml）

pH7.0

pH4.0

Z

P

几何均数

范围

几何均数

范围

孢子相液基

2.3930

0.015～32

43.7133

4.00～256

6.625

<0.001

菌丝相液基

4.3813

0.015～16

23.9566

0.03～128

6.630

<0.001

Z

0.264

4.863

P

0.792

<0.001

表4 特比奈芬抗60株白色假丝酵母菌的MIC值分布情况

pH

液基

抗真菌药物浓度（μg/ml）

耐药率（%）

0.015

0.03

0.06

0.125

0.25

0.5

1

2

4

8

16

32

64

128

256

7

孢子相液基

1

4

3

0

3

1

8

6

10

 6

13

 5

 0

 0

0

66.7

菌丝相液基

1

0

1

0

1

3

3

5

 8

30

 8

 0

 0

 0

0

85.0

4

孢子相液基

0

0

0

0

0

0

0

0

 1

 3

15

 8

17

14

2

100.0

菌丝相液基

0

1

0

0

0

0

0

0

 0

 3

23

21

10

2

0

98.3

表4显示在不同pH环境下特比奈芬抗60株白色假丝酵母菌二相性的MIC值分布情况。

3  讨论

3.1 孵育时间对5种抗真菌药物抗白色假丝酵母菌的MIC值的影响

近年来有研究认为，可应用更短的药敏时间指导临床用药，因提供及早、及时的治疗可能有更好的抗真菌疗效。一些学者在进行氟康唑药敏实验时，参照其48h的判断标准来判读24h结果，发现依据24h结果用氟康唑治疗获得的临床疗效与48h结果相似，甚至24h结果更有临床意义，因为随着时间的延长，拖尾现象加重，可能会导致虚假的氟康唑耐药 [3-5]。

文献报道，伊曲康唑、氟康唑抗白色假丝酵母菌24h与48h的MIC值基本符合率为96%、99% [3]。本实验表明，所有受试菌株24h的生长对照生长良好，各药物24h和48h基本符合率达91.2%～100%，氟康唑24h与48h药敏符合率（96.1%）与既往报道相似。观察氟康唑结果可发现24h结果较48h结果容易判读，因为48h较24h明显出现拖尾现象，导致产生小差异。伊曲康唑的药敏符合率较低（81.4%），原因主要表现为小差异（18.6%），其概率较既往报道高。造成差异的原因可能是24h时伊曲康唑有一部分MIC等于0.125μg/ml，即等于界点，随着时间延长，菌继续生长，当达到48h时，此前判断为敏感的菌进入了剂量依赖敏感范围。

读取24h的结果，原则上需有一个24h界点，本实验中所有的24h和48h结果皆参照NCCLS推荐的48h药物质量浓度界点。目前有两种观点，一种是认为两个时间的药敏符合率很好，没有必要调整新的界点 [3]，而另一种认为可能要更深入地研究24h的药物质量浓度界点，以进一步建立一个判断标准[5]。本实验表明，5种药物抗白色假丝酵母菌的48h与24h的药敏符合率较好，故认为没有必要调整界点。

此外，本实验中，48h白色假丝酵母菌对伊曲康唑的敏感率（54.9%）与既往报道（60.22%）相似。但同为唑类药物，伊曲康唑对白色假丝酵母菌的作用较其他药物差，这可能与其化学性质有关。体外的药敏实验液基的pH为7.0，而伊曲康唑有弱碱性（pKa=3.7），其在低pH环境下电离为离子状态，能更好地发挥抗真菌药效。体外药敏实验中伊曲康唑表现虽不及其他抗真菌药，但有伊曲康唑在临床上疗效很好的报道，其治疗急性VVC的效果与氟康唑相似，治疗中重度VVC起效快且作用持久，尤其用于治疗复发性VVC，临床疗效优于氟康唑[6,7]。体外药敏结果与临床疗效不符，除了与伊曲康唑的化学性质有关，亦反映了体内外药敏的差异。而且，VVC的临床症状与菌丝相相关，伊曲康唑对中重度VVC疗效好，提示伊曲康唑对菌丝相的抗菌活性较强，这有待于进一步研究。

24h与48h结果相比，有大差异出现。既往研究发现，部分菌株在24小时判读为敏感株而在48小时判读为耐药株，这些菌株通过侵袭性假丝酵母菌病小鼠模型的体内试验发现其实际为敏感株[8]。在临床VVC患者中，有时其阴道白色假丝酵母菌鉴定为耐药菌株，正规用药后，临床症状可明显缓解且治愈，这除了反映了体外药敏与体内实际抗菌效能的偏差外，不能排除体外药敏试验由于时间影响而将实际的敏感株判断为耐药株的可能。

3.2 二相性对特比奈芬抗白色假丝酵母菌的MIC值的影响

特比奈芬具有广谱抗真菌活性，有亲脂性和亲角质性，服药后在皮肤、毛发和甲板中组织浓度较高，对各种浅部真菌病疗效较好，皮肤科运用较为广泛。研究发现，在中性环境（pH7.0）下，特比奈芬对白色假丝酵母菌菌丝相的抗菌活性强于孢子相[2]。本实验对阴道来源的白色假丝酵母菌用孢子相液基和菌丝相液基行药敏实验，以评价特比奈芬在妇科VVC中的应用价值。

我们发现，在中性环境（pH7.0）下，特比奈芬对白色假丝酵母菌孢子相和菌丝相的抗菌活性无统计学差异（P=0.792），这与既往的研究报道不符，可能与白色假丝酵母菌的来源有关。本实验中的59株临床株均来源于VVC患者的阴道分泌物，与既往报道中的白色假丝酵母菌临床株来源于皮肤、血液、口腔等有所不同。Tavanti A等[9]通过对白色假丝酵母菌行多位点序列分型发现，不同解剖来源、不同区的白色假丝酵母菌基因型不同，来源于不同的白色假丝酵母菌分化枝。不同的基因型可能导致白色假丝酵母菌对抗真菌药物的敏感性不同。

3.3 pH环境对特比奈芬抗白色假丝酵母菌的MIC值的影响

常规的真菌药敏实验的pH均为7.0，而阴道为酸性环境（pH4.0），正常pH为3.8～4.5，VVC患者其阴道pH也多在此范围内，无论口服用药还是阴道用药治疗VVC时，药物发挥作用的局部环境亦为酸性，故本实验采用pH7.0和pH4.0的液基行药敏试验。 

Konno N等 [10]认为，pH4.0时白色假丝酵母菌菌丝的生长受到抑制，但亦有研究[11] 认为，白色假丝酵母菌形成菌丝相时的重要影响因素并非pH，而是低浓度葡萄糖。本试验的菌丝相液基中含有低浓度葡萄糖及胎牛血清等菌丝相生成的诱导因子，在pH4.0环境中，亦可见丰富的菌丝和假菌丝，这与后者的研究结果相符。本研究结果显示，在酸性环境（pH4.0）下，特比奈芬对阴道白色假丝酵母菌菌丝相的抗菌作用强于孢子相（P<0.001）。

研究发现，白色假丝酵母菌有500个基因受pH的调控，且其细胞壁结构受pH、温度等因素的影响[12]。由实验数据可见，无论是酵母相还是菌丝相液基，特比奈芬在中性环境（pH7.0）下的抗阴道白色假丝酵母菌活性强于酸性环境（pH4.0）（P<0.001）。造成这种差异的原因尚不清楚，可能与药物的化学性质有关，亦可能在不同pH环境下白色假丝酵母菌的细胞结构不同，从而导致对药物的敏感性不同。

综上所述，白色假丝酵母菌的药敏实验结果受孵育时间、二相性、pH环境的影响。常用真菌药敏纸片扩散法、E-test法一般在16～24h判读结果，本实验采用微量液基稀释法表明，5种抗真菌药物的24h与48hMIC值的基本符合率很高，其药敏符合率亦较高，药敏差异主要表现为小差异，而且既往研究发现某些出现大差异的菌株行体内试验时实则为敏感株，因此，24hMIC值可以提供及早及时的临床治疗指导。本实验中仅研究了二相性及pH对特比奈芬MIC值的影响，尚有待于对其他5种药物在不同相性不同环境下的药敏结果进行比较。普通的中性环境下的药敏实验并不能很好地反映不同来源菌株的体外真实药敏水平，提示可能需根据菌群来源及其生长环境行药物敏感试验。