槲皮素对HeLa细胞中HPV18 E7、P16 mRNA表达的影响

　　癌基因与抑癌基因多为特异性的细胞周期调节物，其结构及功能异常往往引起细胞周期调节失控，导致细胞癌变及肿瘤发生。细胞周期中G₁－S期的调控是细胞周期中的关键调控点，P16蛋白和CyclinD蛋白直接参与细胞周期G₁－S期的调控，与肿瘤的发生发展密切相关。槲皮素是一种在植物界中广泛分布的天然黄酮类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗病毒等多种生物活性。已有研究表明，槲皮素对膀胱癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、白血病等多种肿瘤细胞的增殖有明显抑制作用^[1,5]　，表现出广泛的肿瘤抑制效应。但其抗癌机制尚未完全明了。本实验另一部分已经证实槲皮素能抑制HeLa细胞的增殖，促进其凋亡，并存在显著的时间剂量依赖性(待发表)。本实验则采用RT-PCR(Reverse Transcription　Polymerase Chain Reaction，逆转录聚合酶链反应)法检测槲皮素对HeLa细胞中人乳头瘤病毒(human　papillomavirus，HPV)18 E7、P16 mRNA表达的影响，旨在探讨槲皮素在细胞周期水平促进HeLa细胞凋亡的可能分子机制，为槲皮素在宫颈癌临床化学预防中的应用提供理论依据。

1  材料与方法

1．1 实验材料

1．1．1 细胞及培养基  HeLa细胞由武汉大学医学院病毒学研究所伍星欣教授馈赠。RPMI 1640培养液为美国Gibco公司产品。小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。
1．1．2 实验药物 槲皮素购自成都超人植化开发有限公司。用DMSO(二甲基亚砜)配成20 mmol／L的储存液，一20℃保存。实验当日以培养液稀释为所需浓度用于处理细胞。
1．1．3 主要试剂  Trizol试剂为美国Invitrogen公司产品。M-MLV逆转录酶为美国Promega公司产品。RNase Inhibitor、dNTP Mixture(各2．5µmol／L)购自大连宝生生物工程有限公司。PCR扩增试剂盒购自上海生工生物技术服务有限公司。Oligo(dT)18、PCR引物均由上海赛百盛基因技术公司合成。其余试剂均为国产分析纯。
1．1．4 主要仪器 FORMA 3111 CO₂水套培养箱(美国)；TL-16R台式高速冷冻离心机(上海)；PCRSystem 2700(Singapore)；紫外分光光度仪(Amersham)；法国VL凝胶成像及分析系统(法国)。

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1．2实验方法

1．2．1 细胞培养  HPVl8阳性的宫颈癌HeLa细胞生长于含有10％小牛血清及10 ⁸U／L青霉素、100g／L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5％CO₂、饱和湿度条件下的恒温密闭培养箱中常规培养并传代，0．25％胰蛋白酶消化，每2-3 d传代1次。
1．2．2 细胞处理与分组 取指数生长期的2．5×10⁵活细胞接种于50 ml的细胞培养瓶中，待贴壁后加入不同浓度的槲皮素(用DMSO溶解后，以培养液稀释成10，20，40 µmol／L)。另设两个对照组：一个为空白对照组(仅加1640培养液)，一个为溶剂对照组(加1640培养液和DMSO，撇皮素的浓度为0)。对照组及每个药物浓度组分别培养24，48，72 h后(细胞密度大约为10 ⁷)提取RNA。各浓度组各培养时间段分别设3个重复瓶。
1．2．3 RNA提取及RT—PCR  按照Trizol一步法RNA提取试剂盒说明书进行总RNA的提取，紫外分光光度仪进行RNA浓度和纯度的测定，A260／A280比值在1.6一1.8之问。提取的总RNA于一70℃保存备用或者立即逆转录合成cDNA模板。cDNA模板制备反应体系包括：1—2 µg总RNA，oligo(dT)1815 pmol，dNTP(each 2．5 µm01)1．5µl，5×Reaction Buffer 4 µl，M—MLV 200 U，RNase Inhibitor 20U，补充ddH₂O至20µl。反应条件：70℃ 5 min，冰
浴5 min；42℃ 60 min，85℃ 5 min，4℃ 5 min。反应结束置于一20℃保存或直接用于PCR。取1µl逆转录产物为PCR模板，反应体系25 µl：lO×PCRBuffer 2．5 µl，上下游引物各0．5 µl，dNTP(2mmol)2．5 µl，Taq DNA聚合酶2．5 U，MgCl 2 (25mmol)1．5µl，补足ddH₂O进行PCR扩增。HPV18E7的特异性扩增引物上游引物：5＇-CATGGACCTAAGGCAACATTGC-3＇， 下游引物：5＇-CTGCTGGGATGCACACCACGG-3＇，扩增片断长度312bp。P16的特异性扩增引物上游引物：5＇-GAAGAAAGAGGAGGGGCTG-3＇，下游引物：5＇-GCGCTACCTGATTCCAATTC-3＇，扩增片断长度340 bp。以 β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照，其上游引物：5-CACCTTCTACAATGAGCTGC-3＇，下游引物：5＇_CAGCTCGTCGCTCTTCT-3＇，扩增片断长度463 bp。扩增条件：94℃预变性4 min;然后94℃变性1 min，50℃(E7基因)退火50 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸10 min，冷却至4℃。P16基因和β-actin基因的扩增条件只是将退火温度分别变为56℃、54℃。三者分别在不同的反应体系中扩增。PCR扩增完毕经含有0．5 g／L溴化乙锭(EB)的1％琼脂糖凝胶电泳分别检测各扩增产物，法国VL凝胶成像及分析系统对电泳条带进行扫描分析，以目的基因(E7、P16)与β-actin扩增条带的实际灰度值的比值作为目的基因mRNA的相对表达水平。
1．3统计学方法 采用SPSS 13．0软件进行统计学处理，计量资料的结果用x(-)±s表示，并采用单因素方差分析(one—way ANOVA)进行比较，以P<0．05为差异具有统计学意义。

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2 结果
2．1细胞总RNA质量分析结果 从HeLa细胞中提取的总RNA经1％的变性琼脂糖凝胶电泳，可见到5S、18S和28S rRNA3条清晰的条带，且28S的亮度约是18S的2倍。证明，总RNA的纯度较高，可用于进一步的实验。
2．2槲皮素对HeLa细胞HPV18 E7 mRNA表达的影响 对照组和各实验组RT-PCR检测结果显示，在312 bp处可见E7的条带(图1)，在463 bp处可见β-actin的条带(图3)。由图可见E7 mRNA在HeLa细胞内呈高表达状态，且溶剂对照组(槲皮素浓度为0)与空白对照组相比E7 mRNA的相对表达水平无差别(P>0．05)。不同浓度的槲皮素对HeLa细胞HPV18 E7 mRNA表达的影响存在显著的时间剂量依赖性(表1)，槲皮素的浓度越高，作用时间越长，E7 mRNA的表达越低。槲皮素浓度40µmol／L组处理72 h，E7 mRNA的相对表达水平最低。不同浓度的槲皮素处理相同的时间，除10µmol／L处理24 h组与溶剂对照组相比无差异性(P>o．05)外，余全部存在显著性差异(P<0．01，与溶剂对照组相比)；各浓度组之间也存在差异性(两两比较，P

2．3槲皮素对HeLa细胞P16 mRNA表达的影响    对照组和各实验组RT-PCR检测结果显示，在340 bp处可见P16的条带(图2)，与预测结果相符(β-actin的条带在463 bp处，见图3)。由图可见P16 mRNA在HeLa细胞内呈高表达状态，且溶剂对照组(槲皮素浓度为0)与空白对照组相比，其mRNA的相对表达水平无差异(P>0．05)。不同浓度的槲皮素对HeLa细胞中P16 mRNA表达的影响存在显著的时间剂量依赖性(表2)，槲皮素的浓度越高，作用时间越长，P16 mRNA的表达越低。处理相同的时间下各浓度槲皮素组与溶剂对照组相比均存在显著性差异(P<0．01)，各浓度组之间也存在显著的差异性(两两比较，P<0．01)。各浓度组P16mRNA的相对表达水平也存在着时间差异性(两两比较，P值均小于0．05)。

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3 讨论
3．1 自1974年Zur Hflusen [6]首次提出HPV感染与宫颈癌密切相关。随后研究发现90％以上的宫颈癌组织中可以检测到高危型HPV的感染。HPV基因组早期转录区的E6、E7基因是高危型HPV最主要的癌基因，具有细胞转化功能，对宫颈癌细胞的恶性表型的维持有重要作用。E7癌基因产物E7蛋白可与有活性的、低磷酸化的pRB蛋白结合，使pRB蛋白高度磷酸化，刺激转录因子E2F从蛋白复合物pRB-E2F中释放出来，激活基因转录进入S期，细胞增殖失控。此外，E7蛋白亦可作用于细胞周期的重要调控蛋白cyclinE、cyclinA、cdk2、P21、P27 ^[7,8] ，使细胞周期紊乱，引起肿瘤发生。P16基因定位于人类染色体9p21区，是大多数肿瘤中失活频率最高的抑癌基因之一。P16基因编码的P16蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶4、6(CDK4、6)的抑制因子，经
CDK—pRB-E2F途径参与细胞周期G1-S转换的调控 ^[9] 。本研究显示在宫颈癌HeLa细胞中E7 mR-NA和P16 mRNA均呈高表达状态，与上述研究结果一致。
3．2 近年来中药槲皮素的抗肿瘤作用日益成为研究的热点。因其具有多种生物活性，能抑制多种肿瘤细胞的增殖，且无明显副作用，被认为是具有较好应用前景的抗癌药物。但是目前关于槲皮素的抗肿瘤机制尚未定论，可能存在以下机制：在细胞周期调控点G₀／G₁、G₁／S、G₂／M冻结细胞周期；与雌激素Ⅱ的结合位点相互作用；抑制糖酵解和若干酶的活性，如PKC、有丝分裂原激活蛋白激酶、细胞分裂周期激酶2、酪氨酸激酶、磷酸肌醇-3，-4，-5激酶。此外也可降低细胞增殖所必需的基因的表达。
 　　本实验前期已通过体内、外实验证实槲皮素能呈时间剂量依赖性的抑制宫颈癌HeLa细胞的增
殖，诱导其凋亡。而本研究发现，槲皮素能呈时间剂量依赖性的下调E7 mRNA和P16 mRNA的表达水平。据此推测槲皮素对宫颈癌HeLa细胞凋亡的诱导作用可能是通过下调E7 mRNA和P16 mRNA的表达水平来实现的。本研究为槲皮素在宫颈癌的临床应用提供了理论依据，为宫颈癌的中药癌化学预防提供了一定的理论指导。但由于细胞周期调控的分子机制复杂多变，且对于不同的肿瘤类型及细胞系其分子机制亦有别，因此若要明确其详尽机制，则需进行更深入的研究。

 

参考文献
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