P21Ras和P-ERK在子宫内膜癌组织中的表达及意义

    子宫内膜癌是原发于子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,是妇科生殖道最常见的恶性肿瘤之一。其发生率约占女性生殖道恶性肿瘤的20％～30％。近年来,发病率呈持续上升趋势。在某些发达国家，内膜癌发病率已位居妇科肿瘤第一位。近来发现信号传导通路与子宫内膜癌的发生关系密切，其中，丝裂原活化蛋白激酶(Ras-Raf-MEK-ERK)途径逐渐成为学者关注的焦点。P21Ras and P-ERK为此通路中的两个关键蛋白。

 

 

    一、标本来源

    选取2005年1月至2007年9月郑州大学第一附属医院病理科存档蜡块81例。其中子宫内膜癌49例，子宫内膜非典型增生性组织20例，增生性子宫内膜12例。三组年龄差异无统计学意义(P>0.05)。全部标本均经病理检查确诊，每例均有完整的临床病理资料。子宫内膜癌患者术前均未接受化疗或放疗。49例子宫内膜癌组织中，患者年龄38~76岁,＜60岁的有22例,≥60岁的有27例；按1988年FIGO组织病理学分级：Ⅰ级（高分化腺癌）与Ⅱ级(中分化腺癌)共33例，Ⅲ级(低分化腺癌)16例；2000年FIGO手术－病理分期：Ⅰ期29例，Ⅱ期14例，Ⅲ期共6例；有淋巴结转移的6例，无淋巴结转移的有43例；浸润肌层深度＜1/2的26例,浸润肌层深度≥1/2的有23例；有合并症 (高血压或糖尿病)者14例，无合并症者35例。

 

    二、主要试剂和方法

    鼠抗人P21Ras单克隆抗体(工作液)购于福州迈新公司，鼠抗人P-ERK单克隆抗体(浓缩液)购于美国Santa Cruz公司，抗体工作浓度取1:100。链霉菌素抗生物素－过氧化物酶法(S-P)超敏免疫组化试剂盒、DAB酶底物显色试剂盒购于中杉金桥技术开发公司。所有标本经10％福尔马林固定，石蜡包埋，４μm厚连续切片，每例标本均切４张。本实验采用链霉素抗生物素－过氧化物酶法(SP)进行免疫染色。具体步骤按照说明书进行，抗原修复方法均为微波修复。每组实验均设阳性对照和阴性对照，用已知阳性片作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。

 

    三、结果判定标准

    两者均以胞浆和(或)胞核出现棕黄色或棕褐色颗粒者为阳性细胞。分别观察染色的阳性和染色强度进行记分。先按阳性细胞所占观察细胞的百分比记分：阴性为0分，阳性细胞≤10％为1分，在11％~50％之间为2分，在51％~80％之间为3分，80％以上为4分。再按染色强度记分，无色记为0分，浅黄为1分，棕黄为2分，棕褐甚至有颗粒为3分。两记分乘积≥3分为阳性，乘积<3者为阴性。

 

    四、统计学处理

    采用SPSS13.0统计学软件行 检验，Pearson相关性分析，检验水准α=0.05。

 

    P21Ras、P-ERK阳性细胞主要位于子宫内膜的腺体。两者均为胞浆着色，呈棕黄色或棕褐色，在某些低分化腺癌的胞核中也见有P-ERK的着色。

 

    一、子宫内膜癌组织中、非典型增生内膜和增生期内膜组织中P21Ras和P-ERK蛋白的表达情况子宫内膜癌组织中P-ERK与P21Ras的阳性表达率(71.43％，75.51％)明显高于非典型增生内膜(40.00％，35.00％)和增生期内膜组织中(8.33％，0)(P＜0.05)。见表1。

    [JZ]表１P21Ras和P-ERK在三组中的表达情况　

    [BG(!]

    [BHDFG3，WK9，WK3，WK8，WK5。2，WK8，WK5。2W]组织类型[]总例数[][ZB（]

    [BHDG1*2，WK8W]P－ERK

    [BH,WK4。2W]阳性数[]阴性数[ZB）][]x2值[]P值[][ZB（]

    [BHDG1*2，WK8W]P21Ras

    [BH,WK4。2W]阳性数[]阴性数[ZB）][]x2值[]P值

    [BHDG1*2，WK9，WK3，WK4。2，WK5。2，WK4。2，WK5。2W]

    子宫内膜癌组织[]49[]35[]14[]17.660[]0.000[]37[]12[]26.145[]0.000

    [BHDW]非典型增生内膜[]20[]8[]12[]5.974*[]0.015*[]7[]13[]10.088*[]0.001*

    [BH]增生期内膜[]12[]1[]11[]13.364**[]0.000**[]0[]12[]19.975**[]0.000**

    [BG）F]子宫内膜癌组织与非典型增生组织相比；**子宫内膜癌组织与增生期内膜组织相比

 

    二、P21ras与P-ERK蛋白的表达与子宫内膜癌临床病理类型的关系

    高中分化内膜癌组织中P-ERK蛋白表达率(60.60％)明显低于低分化的腺癌组织(93.75％) (P＜0.05)；Ⅰ期中P-ERK蛋白的表达阳性率(58.62％)，Ⅱ期P-ERK蛋白表达率(85.71％)，明显低于Ⅲ期(100％)(P＜0.05)；肿瘤浸润肌层深度＜1/2者P-ERK蛋白阳性表达率(53.85％)明显低于浸润肌层深度≥1/2者(91.30％)；P-ERK的表达与有无淋巴结转移、有无并发症及患者年龄无关。P21Ras蛋白在高中分化内膜癌组织中的表达率(63.63％)显著低于低分化的腺癌组织(100％) (P＜0.05)。见表２。

 

    三、P21Ras与P-ERK蛋白的表达的相关性分析

　经Spearman等级相关分析，两者在子宫内膜癌中的表达呈正相关关系(rs=0.480，P＜0.05)。见表３。

 

    [ZT(][JZ]表2 P21Ras和P-ERK在不同临床病理参数下的表达情况

    [BG(!]

    [BHDFG3，WK11，WK3，WK6，WK5。2，WK6，WK5。2W]临床病理特征[]N[][ZB（]

    [BHDG1*2，WK6W]P－ERK

    [BH,WK3。2W]阳性[]阴性[ZB）][]x2值[]P值[][ZB（]

    [BHDG1*2，WK6W]P21Ras

    [BH,WK3。2W]阳性[]阴性[ZB）][]x2值[]P值

    [BHDG3，WK6，WK5，WK3，WK3。2，WK5。2，WK3。2，WK5。2W]

    病理学分级[]G1+G2G3[]3316[]2015[]131[]7.538[]0.006[]2116[]120[]5.864[]0.015

    [BHDWG4*2]FIGO分期[]ⅠⅡⅢ[]29146[]17126[]1220[]6.131[]0.047[]19126[]1020[]4.300[]0.116

    [BHG3]淋巴结转移[]有无[]643[]233[]410[]2.968[]0.085[]334[]39[]1.091[]0.296

    [BH]肌层浸润深度[]＜1/2≥1/2[]2623[]1421[]122[]8.391[]0.004[]1720[]93[]3.071[]0.08

    [BH]年龄[]＜60岁≥60岁[]2227[]1619[]68[]0.033[]0.856[]1720[]57[]0.067[]0.796

    [BH]并发症[]有无[]1435[]827[]68[]1.960[]0.162[]1027[]48[]0.177[]0.674

    [BG）F][ZT)]

 

    [JZ]表３　P21Ras与P-ERK蛋白在子宫内膜癌中表达的相关性

    [BG(!]

    [BHDFG3，WK8，WK16，WK8。2W]P-ERK表达[][ZB（]

    [BHDG1*2，WK16W]P21Ras表达

    [BH，WK8。2W]＋[]－[ZB）][]rs[]P

    [BHDG3，WK8。5W]＋－[]316[]48[]0.480[]0.000

    [BG）F]

 

    P21Ras蛋白为膜结合型的GTP/GDP结合蛋白，为Ras基因编码，分子量21kD，所以常称其为P21Ras蛋白。P21Ras蛋白定位于细胞膜内侧，具有GTP酶活性，可将GTP转化为GDP。它在有活性的GTP结合型与无活性的GDP结合型之间循环变换，是细胞增殖和分化的关键调节分子之一。与GTP结合时P21Ras呈活化状态，激活胞浆内的丝氨酸/苏氨酸激酶，将有丝分裂信号传递到细胞核中。P21Ras蛋白的GTP酶活性将GTP水解为GDP，可导致其呈失活状态(P21Ras－GDP)。P21Ras激活是生长因子与受体酪氨酸激酶结合后引发的非常普遍的信号传导通路。Ras基因发生突变时，其蛋白结构改变，从而使其GTP酶的水解能力下降，使P21Ras蛋白呈持续活化状态，持续不断的将信号传入细胞，使细胞不断增殖或癌变。突变的P21Ras通过下游的Raf－MEK通路激活ERK，并改变或修饰相关基因的表达。ERK是由Boulton等于20世纪90年代初期分离鉴定的一种蛋白激酶。P-ERK是其活化形式，可介导信号由胞质向胞核传递，参与调节细胞的生长发育分化分裂等多种生理过程。平时ERK位于胞浆内，一旦被激活，可迅速穿过核膜，再激活转录因子或/和P70核蛋白体S6激酶。P-ERK可调节某些转录因子的活性如EIk-l, c-Myc, STATs, Jun, Fos等，这些转录因子进一步调节各自的靶基因转录，引起相应蛋白的表达或活性改变，最终可影响细胞代谢和功能，产生特定生物学效应。

    本研究发现，P21Ras蛋白在子宫内膜癌和非典型增生组织中均有表达，在正常增生期子宫内膜中无表达。且子宫内膜癌中的阳性表达率显著高于非典型增生内膜与正常内膜组织。这种从正常到癌组织的表达增高提示在正常组织向不典型增生组织及肿瘤组织转化过程中有P21Ras的活化。在分化程度不同的内膜癌组织中，P21Ras的表达差异具有统计学意义。本研究显示，分化较好的癌组织，如高中分化的<