雌性大鼠老化过程中脾细胞雌激素受体含量及白细胞介素-2、肿瘤坏死因子活性的变化

    【摘要】 目的 探讨雌性大鼠老化过程中血清雌激素浓度、脾细胞雌激素受体(ER)含量及白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)活性变化的相关性。方法 以各月龄组雌性大鼠为研究对象，应用放射免疫法、放射配体结合分析法、MTT法及细胞毒法等技术，观察上述各指标随老化的变化。结果 随着老化雌性大鼠血清E2 浓度与脾细胞ER含量及脾细胞诱生IL-2、TNF活性均明显下降，并呈明显正相关。结论 生理水平血E2 对脾细胞ER有正向调节作用，雌激素可能通过免疫细胞ER来调节免疫功能。随着老化到来，雌激素水平下降及免疫细胞ER含量降低，这可能是老年机体免疫功能衰退的原因之一。 
   关键词：老化；脾细胞；雌激素受体；白细胞介素-2；肿瘤坏死因子
Observation on the changesof splenic ER, IL-2 and TNF levels in aging female rats 
WANG Wenjun,YU Jin,LI Dajin,et al.
Obstetrics and Gynecology Hospital,Shanghai Medical University,Shanghai,200011 
【Abstract 】 Objective Toinvestigate the relationship between serum E2 , splenic estrogen receptor (ER)and IL-2, TNF levels in aging female rats. Methods In aging female rats, ER proteins of splenic cells were determinedwith radio-ligand binding assay, estrodial concentration of serum with RIA, and activitiesof IL-2 and TNF with MTT and cytotoxic methods. Results With aging, levels of serum E2 and ER of splenic cellsand IL-2 and TNF activities decreased progressively in female rats. Positive correlationexisted between levels of serum E2 and splenic ER and between levels of splenicER and IL-2 and TNF activities in aging female rats. Conclusions Splenic ER is generally up-regulated by serum estrogen level.Estrogen may regulate the function of immune system via ER on immune cells. In aging rats,decrease in serum E2 leads to fading of ER in immune cells and may results inlow immunity.
【Key words 】 Aging Splenic cells Estrogen receptor Interleukin-2 Tumor necrosis factor 
妇女进入围绝经期后，随着卵巢功能减退，雌激素(E)分泌减少，由此生理机能及代谢方面发生很大变化，如出现潮热、情绪变化、心血管系统病变及骨质疏松〔1〕 ，不仅如此，免疫系统也渐衰退〔2〕 ，其中突出的是对免疫调节起重要作用的细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF)等活性明显下降〔3-6〕 。鉴于围绝经期以后E的变化与免疫功能的下降呈明显同步关系，而且国内近年提出〔7〕 ，进入围绝经期以后人体内免疫细胞上雌激素受体(ER)明显减少，由此我们推测免疫功能的下降可能与免疫细胞上ER有一定关系。为了进一步探讨机体雌激素与免疫功能的关系，我们以雌性大鼠为研究对象，观察其随老化脾细胞ER含量以及脾细胞诱生IL-2、TNF活性的变化，并探讨其机理。 
材料和方法 
一、动物分组 
取3、7、12、15、18月龄雌性SD大鼠(由上海医科大学实验动物部提供，清洁级标准饲养)，每组5只，放血处死。血标本留测血清雌二醇浓度。取出脾脏，一部分干冰速冻，液氮保存，待测ER；另一部分作IL-2、TNF诱生(以ConA作诱生剂)，24小时后取上清液，-20℃保存，待测IL-2、TNF活性。
二、方法 
1.大鼠脾细胞ER测定：采用放射配体结合分析法(羟基磷灰石吸附分离)—HAP法，主要参考Chae氏法〔8〕 。取新鲜冻存大鼠脾脏，去除周围脂肪和结缔组织，称重，剪碎，按1:6(重量：体积)加入冰冷抽提液TGM(10mmol/LTris-HCl，pH 7.5,10％Glycerol,3mmol/L MgCl2 ,1.5mmol/L EDTA,20 mmol/L Na2 MoO4 ,1mmol/LPMSF及0.4mol/L KCl)，高速分散器匀浆，匀浆液于1小时后在4℃ 17000g离心40分钟，取上清液，测定蛋白浓度，进行3 H-雌二醇与受体的单点饱和结合分析以比较细胞ER受体数的多少。在200μl反应体系中，加入600μg蛋白抽提液及饱和浓度的3 H-雌二醇(15nmol/L)，(饱和浓度根据Scatchard作图而定，据Scatchard作图，Kd=0.36nmol/L;3 H-雌二醇为中科院上海原子核所产品，放射性比强度73ci/mmol，放化纯度>95％)，测定非特异性结合量另加200倍3 H-雌二醇量的己烯雌酚，置4℃18小时，再置冰浴10分钟，加60％HAP0.3ml，置冰浴15分钟，用冰冷洗脱缓冲液抽滤，每次5ml，共3次，烘干膜上HAP，放入5ml闪烁液中，FJ-2105型液闪计数仪上计数得cpm值。总结合管cpm减去非特异性结合管cpm，得特异结合cpm，换算成每毫克蛋白(pro)中ER的fmol数。为使实验结果更具可靠性，每个标本测定均设三复管，取其平均数。将同一样品分成4份，同时测定3 H-雌二醇的特异结合量，平行管间的变异系数为6.4％。
2.大鼠血清E2 浓度测定：由上海市内分泌研究所按放射免疫法常规方法测定。大鼠雌二醇放免药盒由世界卫生组织提供。
3.IL-2的活性测定：采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法，参照Mossman检测法〔9〕 改进。收集生长良好CTLL-2细胞(由中科院上海细胞生物学研究所提供)，用RPMI1640液制成浓度为1×105 /ml的细胞悬液。倍比稀释标准品及待测样品，加每孔100μl入96孔平底细胞培养板，每孔加100μl上述细胞悬液，另设4个对照孔，只加100μl细胞悬液和100μl培养液。37℃5％CO2 培养36小时，每孔加MTT溶液(5mg/mlPBS)10μl，震荡1分钟，37℃孵育4小时，各孔加100μl酸化异丙醇(0.04mol/LHCL)，混匀，置数分钟，测定OD值，将待测样品的OD值与标准品OD值比较后求得待测样品的IL-2活性。
4.TNF的活性测定：采用细胞毒法，参照Krammer检测法〔10〕 改进，详法参见文献〔11〕 。
5.统计学处理：实验数据采用±s表达，数据处理采用t检验及方差分析。 

表1 雌性SD大鼠各不同月龄组血清E₂ 浓度、脾细胞ER水平及IL-2、TNF活性的比较(±s)
Tab 1 Serum E₂ , splenic ER, IL-2 and TNF in female SDrats of different ages