【据《Nature Communications》2014年10月报道】题：治疗性HPV DNA疫苗：有望清除HPV持续感染与CIN3（作者Kim TJ等）

    宫颈癌是世界范围内女性肿瘤患者死亡的主要原因，75%由高危HPV16/18亚型持续感染引起。HPV持续感染时，HPV E6、E7作为病毒致瘤蛋白，结合及促进肿瘤抑制蛋白p53及pRb的降解，但机体缺乏HPV特异的T细胞免疫反应性，对于宫颈肿瘤或癌前病变的患者，病毒特异的T细胞一般无功能或是功能被抑制。对特异T细胞的功能修复是HPV导致宫颈癌发生的重要因素。宫颈病变CINⅡ~Ⅲ如合并HPV16感染，则有30%概率发展为宫颈浸润癌。目前，CINⅡ~Ⅲ的治疗方式为锥切手术，但10%可能复发且存在妊娠并发症如早产、低出生体质量儿、胎膜早破等发生可能。目前预防性疫苗Gardasil/Cervarix可有效预防HPV感染，但对于已有HPV感染或癌前病变者并无明显治疗作用，故有必要开发针对HPV感染相关癌前病变的治疗性疫苗。

    来自韩国关东大学的Kim等通过电穿孔加强免疫开发了HPV DNA疫苗GX-188E，在9例CIN3患者体内，该疫苗将HPV抗原提呈给树突状细胞，产生E6/E7特异的IFN-γ介导的T细胞反应。其中8例患者产生加强的多功能HPV特异的CD8 T细胞反应：细胞反应性增强、增殖能力增加或效应分子分泌增加。7例患者在36个月随访发现宫颈病变消退、病毒被清除。研究发现，针对疫苗可产生大量CD8 T细胞反应，导致组织、细胞及病毒反应，治疗性疫苗能有效治疗HPV持续感染及宫颈病变，并且GX-188E不会发生严重的疫苗相关性不良反应。

GX-188E安全，可以被接受

    GX-188E疫苗可表达HPV16、18E6/E7蛋白，融合表达于Flt3L及组织纤溶酶原激活物信号区域的胞外区域，目的是促进抗原呈递及运输融合蛋白到分泌通路。GX-188E通过对HPVE6/E7基因重新改组，改变第16位氨基酸重叠序列以减少T细胞识别结合区域。基因改组的目的是防止E6/E7融合蛋白的二聚体产生，这一过程对于p53、pRb的降解至关重要。

    根据纳入及排除标准，共9例CINⅢ受试者被纳入，分别于第1、4、12周给予三剂GX-188E，共49例不良事件（AEs）发生：23例不良反应包括湿疹、瘀斑、阴道瘙痒、失眠、厌食、头晕，被认定与疫苗无关。另19例不良反应包括寒战、注射部位疼痛、肿胀、感觉减退，被认为与GX-188E相关。还有2例为不明原因的头痛、鼻炎与疲劳，被认为与疫苗相关。所有AEs被认定为轻微（1级），并在3天内完全恢复，无严重不良反应或实验室异常。有学者认为注射Flt3L蛋白可引起白细胞增多，本研究未发现白细胞有明显改变，可能原因是GX-188E疫苗不会使血中Flt3L明显上升，这一发现与之前报道的DNA疫苗如cytokines及HSP70一致，表明DNA疫苗一般不会产生不良反应。为了检测疫苗的免疫安全性，GX-188E注射后，检测抗DNA抗体发现其水平低于检测限值，说明DNA疫苗是可以接受的，不会产生自身免疫反应。

GX-188E可产生较强的细胞免疫反应

    注射GX-188E后观察各个时间点：VS（接种前两周）、VT2（接种后2周）、VT4（接种后8周）、VF1（接种后20周）、VF2（接种后36周）。应用酶联免疫斑点测定法（ELISPOT）发现：除1例受试者在疫苗接种前即发现IFN-γ反应，其他8名受试者同样也存在HPV特异的免疫反应，但较弱。在疫苗接种后，所有受试者均出现E6、E7特异IFN-γ反应性明显增加，其中2例受试者在接种1剂后即出现明显的IFN-γ反应增加，5例在接种2剂后明显增强，其余2例在接种3剂后反应增强，表明疫苗注射后细胞免疫反应性显著增加。同时研究发现，E6抗原的反应性较E7更强（69%~89% vs 11%~31%）。GX-188E疫苗所致E6/E7特异记忆T细胞反应，在最后一剂接种后，可保持至少24周。利用细胞因子染色技术（ICS）发现：HPV16特异IFN-γ+CD4T细胞反应在9例患者中均出现，IFN-γ+CD8T细胞反应在8例患者中出现。除了一例以外，GX-188E可激活HPV16特异CD4、CD8T细胞反应。持续HPV感染可损伤Th1细胞对HPV的反应，导致肿瘤发生。未接种前，Th1效应细胞因子如IFN-γ、IL-2及肿瘤坏死因子（TNF-α）显著低表达。接种后，上述几种因子表达明显上升（IFN-γ、IL-2、TNF-a分别提高49.9、13、22.9倍）。结果显示，GX-188E可导致较强的Th1极化的HPV特异的细胞免疫反应，但Th2（IL-4、IL-10）及Th17（IL-17A）增加并不明显。

GX-188E疫苗可产生有功能的CD8 T细胞

    通过刺激HPV16 E6及E7多肽，体内可产生五种不同功能的效应因子:IFN-γ、IL-2、TNF-α、趋化因子（MIP-1β）及细胞毒活性。8/9例受试者接种后与接种前比较，可产生有功能的HPV特异性CD8T细胞。

GX-188E产生针对E7蛋白抗体反应较弱

    通过稀释酶联免疫吸附对血浆样品针对E6、E7总IgG抗体反应进行测定：在VS期几乎所有受试者可检测到微量或者无法检测到E6及E7蛋白的抗体，说明在接种疫苗之前，体内不存在有效的E6、E7蛋白特异性抗体。在接种疫苗之后，3/9例产生微弱的抗E7的抗体，滴度总1:8升至1:256，但是针对E7抗原的T细胞免疫反应要弱于E6。

GX-188E疫苗可清除HPV感染及病灶

    在36周的临床试验后， 通过对HPV感染状态、细胞学检测以及宫颈病变的组织学检查对GX-188E疫苗的临床有效性进行评估。在VS期，9例受试者通过阴道镜病理学诊断为CIN3（原位癌），在最后一剂疫苗接种8周后，6/9例受试者宫颈病变消失，其中3例在接种完第2剂疫苗第12周后细胞学检测正常；3例在接种完第3剂疫苗后细胞学转阴；另一例则在36周结束后病变消失，并且这6例在之后的随访中均未出现CIN复发。9例受试者在入组时，均有HPV16感染，1例同时合并HPV18型感染。在接种疫苗后第2剂疫苗接种后第12周有5例受试者HPV被清除，其余2例中，1例在20周被清除，另1例在36周后被清除。HPV感染与临床病变清除率为78%（7/9）。同样，在3例接种早期及出现CIN及HPV均清除的受试者体内检测到大量HPV特异性多功能CD8T细胞反应，其余4例在接种后20周以及随访完成先后出现CIN及病毒清除的受试者也出现了多功能CD8T细胞反应，对疫苗无反应者同样体内未检测到特异的T细胞反应。这进一步说明GX-188E疫苗对宫颈病变及病毒感染的清除与HPV特异性多功能CD8 T细胞反应相关。