B . animalisV9对腹泻动物的保护性作用及其机制研究

高鹏飞², 孙志宏¹, 麻士卫², 王秋实², 高杰², 邓承远², 张和平¹*

(1内蒙古农业大学, 乳品生物技术与工程教育部重点实验室, 呼和浩特 010018)

(2内蒙古轻工科学研究所, 呼和浩特 010050)

【摘要】　目的研究益生菌 B. anim alis V9对腹泻动物的保护作用及其对腹泻致病菌的拮抗效果。方法　采用自制的腹泻 SPF鼠 ,喂服 B. animalis V9,观察并检测腹泻致病菌 ,并在体外试验益生菌 B. anim alis V9对腹泻致病菌的拮抗作用。结果SPF鼠致泻动物模型喂食 B.anim alis V9,剂量为 1. 0 ×108CFU / (只·d) , 3 d后腹泻治愈率为 90% ,死亡率为 9% ,对照组自然恢复率为 16% ,死亡率为 41% ,其余仍有不同程度的腹泻现象。B. anim alis

V9在体外对志贺痢疾杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌有不同程度的拮抗作用 ,共同培养 60 h后均未检测到上述 4种致病菌。结论B. animalisV9可以有效的对腹泻小鼠进行治疗 ,其机制在于 B.animalisV9对致泻菌株具有一定程度的拮抗作用。

【关键词】　益生菌 B. anim alis V9;腹泻 ;致菌株 ;拮抗

【中图分类号】R378. 992　　　　【文献标识码】A

Study on the protective effect and mechanism of B.animalis V9 on m ice with diarrhea GAO Peng-fei^{1, 2}, SUNZhi-hong¹,MA Shi-wei²,WANGQiu-shi², GAO Jie²,DENGCeng-yuan², SUN Jie-yu², ZHANG He-ping¹

(1. Key Lab of Dairy B iotechnology and Bioengineer, Eudcation M inistry of China, InnerM ongolia AgriculturalUniversity, Huhhot 010018, China; 2. InnerM ongolia Light Industrial Instituteof Research, Huhhot 010050, China)

【Abstract】　ObjectiveTo investigate the protection ofB.animalisV9 to animalswith diarrhea and its antagonistic effect to pathogenicbacteria inducing diarrhea. M ethodSPF white mice with diarrhea were fed with B. anim alis V9 at a doseof 1. 0 ×108CFU /d. Pathogenic bacteria were observed and detected. Theantagonistic effect of B. anim alis V9 to pathogenic bacteria in vitrowasinvestigated. ResultIn test group, the cure ratewas 90% and the death ratewas 9% after

3 days, wihle in control group, the naturalrecovery rate was 16% and the death rate was 41%. B. animalisV9 showed an2 tagonisticeffect to Shigella dysenteriae, Salm onella, Pseudom onasAeruginosa,Escherichia coli and the four pathogenic bac2 teria were not detected in theco2culture after 60 hours in vitro. ConclusionB. anim alis V9 can cure diarrhea in white

mice effectively due to its antagonisticeffect to pathogenic bacteria inducing diarrhea.

【Key words】　B. anim alis V9;Diarrhea;Pathogenic bacteria;Antagonistic

腹泻在我国属于常见病、多发病,引发原因多为环境、饮食引起的外源性肠道腹泻微生物感染。本文以 1株分离于健康蒙古族儿童的具有良好益生特性的动物双歧杆菌乳酸亚种 B ifidobacterium anim alis subsp. LacticV9为研究对象 (B. anim alisV9具有较强的人工胃液和人工肠液的耐受性 ,在 pH 2. 0的人工胃液中厌氧培养 3 h后接入 pH 8. 0的人工肠液中消化 8 h,存活率为 99. 7% ,并且可以耐受 0. 3%的牛胆盐[1 ]) ,采用该菌株对腹泻模型 SPF鼠进行喂食治-疗 ,并进一步研究 B. anim alis V9对常见的致泻菌株(志贺痢疾杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌)的体外拮抗作用。

1　材料与方法

1. 1　材料

1. 1. 1　动物SPF ( specific2pathogen free)小白鼠106只 ,雌雄各半 ,体重 (20. 36 ±1. 62) g,购回后适应性饲养 3 d后分组进行动物实验。实验前禁食6 h,但可自由饮水。

1. 1. 2　供试菌株B. anim alis V9、福氏志贺痢疾杆菌 (S. flexneri) 51571、鼠伤寒沙门菌 (S. typhim urium )50115、铜绿假单胞菌 (P. aeruginosa) ATCC 27853和致病性大肠埃希菌 (E. coil, ETEC) 44155由内蒙古农业大学乳品生物技术与工程教育部重点实验室提供。

1. 1. 3　培养基^{[6 ]}　培养和检测 B. anim alis V9分别用 TPY液体和固体培养基;培养志贺痢疾杆菌、沙门菌采用胆盐乳糖培养基 (BL) ,检测用 S. S琼脂培养基;培养和检测铜绿假单胞菌分别用 NAC液体和固体培养基;培养大肠埃希菌用胆盐乳糖液体培养基,检测用伊红美兰琼脂培养基 ;采用 KV培养基选择类杆菌 ;采用 MRS培养基选择乳杆菌 ;采用 TPY培养基选择双歧杆菌 ;采用 EMB培养基选择肠杆菌;采用EC培养基选择肠球菌。

1. 1. 4　仪器与试剂　氨苄青霉素,组织捣碎仪,厌氧罐 (BBL Gas park) ,OLYMPUSBX50型光学显微镜及OLYMPUS PM220型摄像系统。

1. 2　方法

1. 2. 1　致泻小鼠模型的建立^{[1, 2 ]}　氨苄青霉素 22. 5g/kg(即 0. 35 g/只 ) ,喂服1次, 8 h后,分组分别喂服鼠伤寒沙门菌[5×10⁷CFU/ (只·次) ]、福氏志贺痢疾杆菌 [2×10⁷CFU/ (只·次) ]、大肠埃希菌 (1×106CFU / (只·次) ]和铜绿假单胞菌 [ 2×106CFU /(只·次 ) ] 1 次 ,小鼠 100%出现腹泻 ,死亡率为11. 65%。

1. 2. 2 B. anim alis V9对致泻小鼠保护作用的研究^[2～4]　活杀 4只健康小白鼠 ,取粪便、盲肠内容物和盲肠膜 (由空肠、回肠、盲肠组织刮去黏膜内容物后捣碎制得 )做对照组的肠道菌群计数分析。

同时对小鼠进行 B.anim alis V9治疗实验 [每次喂服剂量分别为2 ×10⁷CFU / (只·d)、4×10⁷CFU/(只·d)和1×10⁸CFU / (只·d) ],以不喂服 B. ani-malisV9的小鼠为对照。每天观察各组小鼠的腹泻情况并作记录 ,在小鼠腹泻痊愈后的次日活杀小鼠 ,并取粪便、盲肠内容物和盲肠膜进行肠道菌群计数分析。

1. 2. 3　样本的采集　活杀 4只腹泻小鼠 ,取粪便、盲肠内容物和盲肠黏膜做肠道菌群计数分析。治疗组在治疗治愈后采集粪便 ,并分批活杀动物做盲肠内容物和盲肠膜的肠道菌群分析以及致病菌的分离、初步鉴定和计数。

1. 2. 4　样本的处理　将粪便和内容物称重后 ,以10倍稀释法稀释成系列浓度。空肠、回肠、盲肠采集后称重 ,轻轻刮去黏膜内容物 ,在充高纯氮气中漂洗3次 ,然后用捣碎器碾碎组织 ,再以10倍稀释法稀释成系列浓度。

取上述合适稀释度 10～20μl滴入KV (选择类杆菌 )、MRS (选择乳杆菌 )、TPY (选择双歧杆菌 )、EMB (选择肠杆菌 )、EC (选择肠球菌 )及 SS(选择沙门、志贺 )琼脂培养基表面 ,用三角棒涂匀 ,前 3种培养基 37 ℃厌氧培养 48 h,后 3种培养基 37 ℃需氧培养 24～48 h,计数活菌数并做详细记录 ,挑取典型菌落涂片染色观察菌落的形态 ,并做简易鉴定。

1. 2. 5 B. anim alis V9与常见致泻菌株的拮抗作用^{[4, 5 ]}B. anim alis V9与腹泻致病菌志贺痢疾杆菌、沙门菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌在TPY中两两混合培养,定时取出培养物,按 10倍稀释法稀释至合适浓度涂布于选择性和非选择性培养基上 , 24或48 h需氧和厌氧培养 (37 ℃)后 ,计数活菌数并记录。

2　结果

2. 1B. anim alis V9对致泻小鼠的保护作用研究

由图 1可以看出 , B. anim alis V9对腹泻小鼠具有明显的治疗作用 ,并有一定程度的剂量作用 ,随着喂食 B. anim alis V9量的增加 ,腹泻小鼠死亡率显著降低 (P < 0. 01) ,治愈率则明显上升 ( P < 0. 01)。

SPF小鼠本身也有一定程度的抗腹泻能力,在致泻后第3天, 16%的小鼠通过自身的免疫调节功能治愈了腹泻 ,但是 41%的腹泻小鼠则由腹泻导致死亡 ,其余小鼠仍有不同程度的腹泻现象。

由图 2、图 3可知 ,腹泻小鼠在喂食 B. anim alis V9期间 ,小鼠粪便中和盲肠内容物中肠杆菌活菌数随着 B. anim alis V9喂食量的增加均明显减少 (P <0. 01) ,类杆菌、乳杆菌和双歧杆菌数量均明显增加(P <0. 01) ,粪便中肠球菌数量几乎不变。盲肠内容物中类杆菌呈先上升后下降趋势。

由图 4可以看出 ,腹泻小鼠在喂食 B.anim alis V9期间 ,盲肠膜中肠杆菌和类杆菌的活菌数随着 B. anim alis V9喂食量的增加变化不大 ,肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌的活菌数明显增加 (P <0. 01)。

2. 2B. anim alisV9与常见致泻菌株的拮抗作用的研究　由图 5可知 , B. anim alis V9对肠道致泻菌株志贺痢疾杆菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌均有不同程度的拮抗作用 ,其中对铜绿假单胞菌的拮抗作用最强 ,在 TPY中共同培养 24 h后 ,铜绿假单胞菌活菌数已经很少 (0. 11 Lg CFU /ml) ,继续培养至 36 h时 ,已检测不出铜绿假单胞菌;对志贺痢疾杆菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌的拮抗效果差异不大 ,共同培养60 h后均未检测出以上 3种致泻菌。

在 B. anim alis V9与致泻菌株两两共同培养时 ,B. anim alisV9活菌数在 72 h内有先增加后减少的趋势 ,但是增减趋势比较平缓。其余 4株致泻菌株在混合培养过程中有较明显的先增加后减少的趋势。

3　讨论

用氨苄青霉素和致泻菌株灌喂小鼠 ,扰乱其肠道正常菌群 ,破坏其微生态平衡 ,以建立一个肠道菌群失调的动物模型 ,供研究 B. anim alis V9保护功效之用。从实验结果来看 ,小鼠腹泻率较高 (100% ) ,死亡率较低 (11. 65% )。因此采用该方法制备肠道菌群失调的动物模型是可行的。

B. anim alis V9对腹泻小鼠具有明显的治疗作用 ,并在一定范围内与剂量呈正相关。SPF小鼠本身也有一定程度的抗腹泻能力 ,在致泻后第3天 , 16%的小鼠通过自身的免疫调节功能治愈了腹泻 ,但是41%的小鼠则由腹泻导致死亡 ,其余小鼠仍有不同程度的腹泻现象。从各类菌群在小鼠粪便中、肠道内以及肠黏膜的定植情况可以看出 ,喂食 B. animalis V9后乳杆菌、双歧杆菌的活菌数均有明显增加 ,而肠杆菌活菌数则明显降低。其原因可能是由于 B. anim alis V9代谢产生乙酸、丙酸、乳酸等有机酸 ,降低了肠道内的 pH和 Eh,从而抑制外籍菌的生长、繁殖^{[5～7 ]}。

腹泻小鼠在喂食 B. anim alis V9期间 ,盲肠膜中肠球菌、乳杆菌和双歧杆菌的活菌数明显增加 (P <0. 01)。双歧杆菌等专性厌氧菌通过与黏膜上皮细胞紧密结合 ,形成一层生物膜印菌群 ,通过占据上皮细胞的空间 ,防止外籍菌的粘附定植 ,起占位性保护作用。专性厌氧菌数量大,在厌氧条件下它的生长速度超过兼性厌氧菌 ,因而在营养物质有限的情况下 ,专性厌氧菌可优势生长 ,使兼性厌氧的潜在致病菌处于劣势状态 ^{[9～12 ]}。

进一步研究双歧杆菌 B. anim alis V9对腹泻动物的保护作用 ,结果显示 B. anim alis V9具有良好的拮抗腹泻致病菌作用 ,能够抑制小鼠肠道致泻菌株的生长繁殖 ,经推测 ,B. anim alis V9对腹泻动物的保护作用是通过 B. anim alis V9的优势生长来抑制肠道致泻菌株和调节肠道正常菌群来实现的 ,具体机制还有待于深入研究。

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