加德纳菌生物膜---细菌性阴道病治疗的新靶点

林思瑶 综述 罗 新 蒋学风 审校

(暨南大学附属第一医院妇产科,广州　510630)

【摘要】生物膜是一种黏附于非生物或生物表面的微生物附着群落,由多糖、蛋白等构成的多聚基质形成。生物膜的形成是一个重要的致病因素，因为它提高细菌对抗生素的耐受性和抗宿主免疫防御系统及吞噬作用。由于细菌生物膜不能有效地被免疫系统清除或不能完全被抗生素杀死，所以往往形成慢性、持续性感染。细菌性阴道病妇女阴道黏膜及性伴侣尿液沉渣均能检测到加德纳菌生物膜。采用甲硝唑或莫西沙星的标准治疗,虽然临床症状消失,但停药后部分以加德纳菌为主的细菌生物膜在生化失活后得以重新复活，导致细菌性阴道病复发。乳杆菌能竞争成为阴道粘膜优势菌群，对于浮游生长及生物膜状态的加德纳菌有很好的治疗作用。促进乳杆菌的生长有利于纠正菌群失衡、恢复正常阴道环境。进一步研究需要评估阴道加德纳菌生物膜结构和成份以深入了解它与细菌性阴道病的关系,为未来靶向治疗提供可能。

Abstract

Biofilm is an aggregate of microorganisms in which cells adhere to non-biological or biological surfaces, which is formed by matrix consisting of the polysaccharide, protein. Biofilm formation is an important pathogenic factor, because it increases bacterial resistance to antibiotics and anti-host immune defense system and Phagocytosis. As the biofilm bacterial immune system cannot be removed effectively, or cannot be killed by antibiotics, it often becomes chronic and persistent infection. Gardnerella vaginalis biofilm is detected in bacterial vaginosis women’s vaginal mucosa or their sexual partners’ urine sediments. Using standard treatment by metronidazole or moxifloxacin, although the clinical symptoms disappear, after stopping treatment the bacterial biofilm mainly consisting of Gardnerella vaginalis will be revived after the biochemical inactivation, leading to recurrent bacterial vaginosis. Lactobacillus competes to become vaginal mucosa microflora, which have a good therapeutic effect of Gardnerella vaginalis in the plankton living and biofilm state. Promoting the growth of lactobacillus flora is beneficial to correct microflora disturbance and restore the normal vaginal environment. Further studies are needed to assess the Gardnerella vaginalis Biofilm structure and composition, which are to better understand the relationship between Gardnerella vaginalis and bacterial vaginosis and maybe provide future targeted therapy.

【关键词】　生物膜;阴道;加德纳菌;细菌性阴道病　

 Key words

 Biofilm; Vagina; Gardnerella vaginalis; Bacterial vaginosis

生物膜(biofilm,BF)是一种黏附于非生物或生物表面的微生物附着群落,由多糖基质、纤维蛋白等将微生物自身包绕其中形成的膜样物结构。是微生物在生长过程中为了适应生存环境而形成的一种与浮游细胞相对应的存在形式。生物膜的形成是一个重要的致病因素，因为它提高病原体对抗生素的耐受性和对抗宿主免疫防御系统及吞噬作用。由于人体免疫系统不能有效清除病原生物膜，或不能完全被抗生素杀死，所以往往形成慢性、持续性感染[1，2]。

全球范围内，细菌性阴道病(bacterial vaginosis,BV)是生育期妇女最常见的阴道炎症性疾病。与阴道滴虫病、淋病、2型人单纯疱疹病毒感染（HSV-2）,艾滋病等性传播疾病，以及早产、胎膜早破等病理妊娠有关；不仅可引起阴道炎和尿道炎、还可引起急性输卵管炎、慢性盆腔炎、手术感染和子宫颈癌等妇科疾病[2]。阴道加德纳菌(Gardnerella vaginalis,GV))是女性非特异细菌性阴道病最常见病原菌,也是性接触传播疾病的病原菌之一[3]。近年来,人们观察到加德纳菌可形成生物膜结构，在BV发病以治疗中扮演重要角色。

{NextPage}1.加德纳菌生物膜致病力与毒力

Patterson等[2]通过体外实验比较了BV及其相关的厌氧菌的细胞毒力、阴道上皮粘附力以及生物膜形成能力等三种毒性特征，发现唯有加德纳菌同时具备三种毒性特征，其它厌氧菌仅仅具备三者之一或无，可见加德纳菌感染是BV发病的关键环节，阴道加德纳菌能形成一个中等和或强力的生物膜结构，除具核梭杆菌能形成一个较松散并容易脱落的生物膜结构外，BV相关的其他厌氧菌不能形成一个稳定的生物膜。阴道加德纳菌显示出了强大的细胞毒作用，能紧密粘附在阴道上皮细胞表面，并形成致密的生物膜。加德纳菌能释放阴道溶细胞素，可能抑制阴道粘膜屏障IgA抗体作用，在阴道上皮利用CD59激活P38分裂原活化蛋白激酶，诱导阴道上皮细胞凋亡[4]。阴道加德纳菌能产生两种水解酶：唾液酸酶和脯氨酸肽酶，能降解几个关键的粘膜保护因子（如粘蛋白），有助于阴道上皮细胞的脱落和裂解[2]。

Harwich 等进一步比较了从有症状的BV和无症状健康妇女提取的两个加德纳菌基因型，两者仅仅一个氨基酸的区别，在同一水平转录，从BV提取的加德纳菌株显示了强大的粘附、聚集和生物膜形成能力，作者提出加德纳菌和阴道壁的粘附能力强弱决定了其是致病株还是共栖株[6]。加德纳菌存在三种特定基因亚型，仅仅两种能够产生唾液酸酶，基因亚型的差别可能与其生物膜形成能力和毒力强弱有关[7]，健康带菌和BV患者阴道德纳菌的基因亚型区别决定了毒力和致病能力。

有研究发现[8],阴道加德纳菌在健康女性生殖道检出率为29%,但在过渡态、中度、重度时检出率分别为76%、93%、97%，提示在加速BV感染进程中,阴道加德纳菌也起到重要促进作用。阴道加德纳菌在健康女性生殖道可大量定植，当生殖道微生态环境改变,保护屏障受损转为过渡态时,阴道加德纳菌极易感染阴道上皮细胞促进BV形成。

2.加德纳生物膜及其传播途径

Swidsinski等[9]采用FISH技术证实在90％的BV患者和10％的非BV妇女可以检测出粘附性的加德纳菌生物膜，其内包裹大量的加德纳菌，通过病理切片和电子显微镜证实粘附加德纳菌生物膜的阴道上皮为线索细胞。粘附生物膜表现为菌群紧密附着于阴道上皮表面，包含3种特异性的细菌属：阴道加德那菌属占60-90%，奇异菌属占1-40%，乳酸菌属占1-5%，无BV的妇女没有典型的细菌生物膜发现,表现为偶发的、分散的乳杆菌或主要由乳杆菌组成的松散的、没有特定结构的生物膜。

阴道加德纳菌感染涉及两性双方并经性接触传播。不仅可以从阴道黏膜检测出加德纳生物膜, 采用FISH检测BV妇女及性伴侣尿液沉渣，均发现加德纳菌生物膜聚集。在男性精液标本中同样能发现它的存在。从人类精子库随机选择20例冻存精液样本,检测出3例含有加德纳菌生物膜[10]。提示人工授精前若不同时对加德纳菌进行检测，常规精液处理不能完全去除加德纳生物膜，有可能造成BV的医源性感染。

3. 阴道加德纳菌生物膜的治疗与复发

阴道加德纳菌的药敏研究监测结果表明其对β-内酰胺类、万古霉素、氯霉素敏感性较高，对大环内酯、克林霉素、四环素、阿米卡星敏感率在60%-79.3%，对氧氟沙星仅37.5%敏感率。[11]目前认为甲硝唑为治疗BV的首选用药。由于加德纳菌单独导致BV很少见，常与厌氧菌共同致病，两者之间存在共生关系。甲硝唑对加德纳菌、革兰阴性菌、厌氧菌均有效， 对乳酸杆菌无抑制作用， 有助于BV患者重建正常的阴道内环境。

Swidsinski等[12]采用口服甲硝唑500mg/次, 1天2次对18例BV患者进行共7天的标准治疗方案。其中16例临床治愈病例在停药1-5周后进行多种细菌(如阴道加德纳菌,奇异菌属,乳杆菌,拟杆菌,大肠杆菌等) 的靶向FISH探针检查,证实阴道黏膜生物膜持续存在,并通过其中3例的动态观察发现在抗生素治疗期间,生物膜代谢不活跃。但在停药5周后,重新检测到了包括加德纳菌属和奇异菌属等代谢活跃的细菌生物膜。标准治疗方案虽然短期消除了临床症状,但不能清除细菌生物膜。治疗时加德纳菌和其他微生物的代谢停止，但停止治疗后再次慢慢地启动，最终导致BV的复发[14]。

Swidsinski等[13] 又采用莫西沙星400mg口服,每天1次对20例BV妇女进行共5天的抗BV治疗。其中15例妇女症状消失,并维持相当长时间,表现为临床治愈, 检测阴道黏膜和尿液沉渣的生物膜的浓度显著降低,奇异菌属浓度持续下降,生物膜中的乳杆菌属数量治疗后回升。加德纳菌在治疗开始时是多种微生物膜的主要成分,治疗起效后,所有尿沉渣和75%的阴道表面不能检测出加德纳菌。但治疗结束10-12周后,在40%的BV患者中可以再次检测出加德纳菌为主的细菌生物膜。这是生化失活的生物膜重新复活所致，而并非新获得的感染。莫西沙星虽能显著抑制生物膜的活性,但同样不能根除BV患者的加德纳菌生物膜,可能是该病复发的重要原因。

{NextPage}抗生素耐药是BV持续或复发的原因之一,生物膜中的细菌对抗生素的反应与其浮游生长方式存在显著差异[14],可能与生物膜降低了抗菌素的穿透性有关。生物膜中的加德纳菌能耐受浮游生长的加德纳菌5倍浓度的H2O2和4-8倍浓度的乳酸。这种耐受力的提高表明生物膜形式对阴道加德纳菌在阴道的乳酸环境下生存更有利。不同生长形式的同一微生物具有不同的生理功能。生物膜也能诱导宿主表达IL-1,IL-8等炎症因子,但关于生物膜对宿主的免疫效应的影响至今认识较少。通过分析生物膜的结构发现,蛋白和核酸成分与浮游形式无显著差别,而碳水化合物高4倍。其中的主要成分是N-乙酰氨基葡糖。蛋白酶K和胰蛋白酶能有效降解生物膜结构,加德纳菌对H2O2和乳酸的敏感性得到了提高,生物膜的降解使细菌对阴道天然免疫的易感性也增强了。然而蛋白酶K和胰蛋白酶都属于非特异性蛋白酶,可能在破坏加德纳菌生物膜的同时破坏阴道上皮细胞[3],因此,探索一种针对生物膜的特异性蛋白酶将是未来治疗的重要一环。

4.加德纳菌生物膜与乳酸杆菌

BV的特点是涉及在乳酸杆菌的相对减少和厌氧菌增殖。BV主要是由阴道加德纳菌与厌氧细菌一起迅速形成生物膜，抵抗抗生素的治疗，使阴道pH值升高，诱发炎症，并取代了阴道内的乳酸杆菌。从健康妇女分离的阴道乳酸杆菌可以减轻加德纳菌生物膜表面积，密度和深度。同时有研究发现体外加德纳菌生物膜与罗伊乳杆菌共培养,能一定程度降低生物膜活性[15]。这些研究表明，乳杆菌能竞争成为阴道粘膜优势菌群，对于浮游生长及生物膜状态的加德纳菌有很好的治疗作用。

Anukam K等[16]对125例病例从第1天到第7天每天口服2次甲硝唑（500 mg），随机从第1天到第30天每天两次口服乳酸杆菌鼠李糖GR-1和瑞特乳酸菌RC-14或者安慰剂。以Nugent评分及唾液酸酶测试和第30天有无BV症状判断疗效。30天后有106例病例返回随访，其中抗生素/益生菌组88%病例治愈，相比抗生素/安慰剂组仅有40%病例治愈。96%益生菌治愈的病例阴道内能检测出大量乳酸杆菌定植，而对照组仅仅56%。Larsson PG等[17]也进行了类似的研究。这项研究表明抗生素与乳酸杆菌联合使用治疗非洲黑人女性BV的有效性。但同时Senok AC等[18]的实验结果并没有提供足够的证据支持益生菌治疗BV。甲硝唑/益生菌疗法和益生菌/三醇制剂的出现似乎显现良好效果，但是这种方法尚需用严格的标准化方法和更多随机对照试验加以证实。促进乳杆菌的生长有利于纠正菌群失衡、恢复正常阴道环境。

{NextPage}5. 加德纳菌生物膜与混合感染

细菌，真菌不仅能单独形成生物膜，而且还可以形成包裹两者的共同生物膜。加德纳菌也不例外，在特定环境下真菌能结合细菌表面的多肽类受体粘附聚集，并进而形成细菌真菌混合生物膜。混合生物膜可能与阴道混合感染有关。该生物膜能促进群体效应分子的合成和分泌，细菌和真菌之间能进行细胞间通讯，促进白假丝酵母菌从菌丝相向酵母相转变；在口腔环境，假丝酵母菌降低生物膜中的氧张力水平，为链球菌提供刺激因子，链球菌同时又为真菌提供营养，促进其生长。两者发挥共存共防、协同致病作用[19]。细菌和真菌混合感染与疾病严重程度和发病频率有关。金黄色葡萄球菌与白假丝酵母菌共同感染小鼠比金葡菌单一感染具有更高的死亡率，提示有致病协同作用。由两种微生物共同形成的基质聚合物更加粘稠，更能抑制抗生素的穿透作用，对抗菌素的抵抗力更强，在口腔链球菌和白假丝酵母菌共同生物膜上已经证实。共同生物膜的形成提高了病原菌对宿主清除作用的抵抗力，宿主针对真菌与细菌共同生物膜的免疫作用还不清楚。阴道内正常的乳酸菌同白假丝酵母菌竞争阴道上皮的粘附位置，释放H2O2、乳酸和其他的脂肪酸，分泌细菌素样物质抑制真菌粘附、侵袭和致病[20]。是否同口腔黏膜一样加德纳菌与白假丝酵母菌形成共同生物膜尚不清楚。进一步研究需要评估生物膜结构和成份以深入了解阴道生物膜与阴道炎症的关系，为未来靶向生物膜治疗提供可能。