【摘要】　目的:探讨HPV亚型在宫颈疾病谱中,即从正常宫颈(慢性宫颈炎) 、宫颈上皮内瘤变(C INⅠ、CINⅡ和C INⅢ)到宫颈癌连续发展中的分布特点。方法:回顾分析2005年6月～2008年6月在我院妇科因宫颈疾病就诊的189例患者HPV亚型检测的结果。结果: HPV总感染率56. 1％ (106 /189) ,复合感染率22. 6％ (24 /106) 。正常者HPV感染率19. 1％ ( 12 /63) ,检测到的HPV 亚型主要是HPV52, 58, 53, 16 和33。CIN Ⅰ者HPV感染率57. 9％ (22 /38) ,最常见的HPV亚型是HPV52,其次是HPV58, 16, 33和18。C INⅡ者HPV感染率70. 5％ ( 31 /44) , HPV52, 16, 58, 33和18等亚型最常见。CINⅢ者HPV感染率89. 3％ (25 /28) , HPV亚型以HPV16, 52, 58, 31, 33为主。宫颈癌患者, HPV阳性率100％ (16 /16) , HPV16检测率最高,其次是HPV18, 52, 58和33。结论:宫颈疾病谱中最常见的高危型HPV亚型是HPV16。不同宫颈病变中HPV亚型感染的差异可能反映了其潜在转归能力,同时提示临床医师应关注宫颈疾病患者高危HPV亚型情况。
【关键词】　乳头状瘤病毒,人;宫颈肿瘤;宫颈上皮内瘤变;基因分型;基因芯片　　

　　现已研究证实,生殖道HPV感染是宫颈癌发生的必要条件。在生殖道黏膜感染的35种HPV亚型中,宫颈癌特殊的HPV感染亚型反映了其潜在的致癌性,也可能反映了感染阶段的流行性[1] 。随着宫
颈疾病的进展,宫颈癌中HPV生长周期通常通过整合病毒DNA到宿主染色体上,提示HPV与宫颈损伤共同进展[2] 。研究表明,不同的HPV感染亚型可能与宫颈癌变的进程和转归相关。本研究利用凯普
基因芯片技术检测了宫颈病变患者HPV的感染情况,以期了解HPV亚型在不同宫颈疾病中分布的特点。

1　资料与方法
1. 1　研究对象　选择2005年6月～2008年6月因宫颈疾病在我院妇科自愿要求且知情同意接受宫颈HPV亚型检测的189例患者,年龄18～76岁,中位年龄32岁,多以接触性出血或异常阴道出血、白带异常、外阴瘙痒、下腹隐痛就诊。189例患者均无CIN、宫颈癌及盆腔放射治疗史,亦无子宫全切除史及妊娠史。所有患者均结合病史、盆腔体检、新柏氏薄层液基细胞学(TCT) 、以及必要的阴道镜活检诊断宫颈疾病。为便于统计,本研究将慢性宫颈炎患者列入正常宫颈范围。

1. 2　受检样本采集　采用凯普宫颈细胞收集保存系统采集保存189例患者宫颈细胞标本各1份。由专业人员用窥阴器暴露患者宫颈,棉签擦拭宫颈分泌物后,将专用的HPV采样刷置于宫颈口,轻轻搓动宫颈刷顺时针旋转5圈采集标本,将其放入标有患者编号的取样管中。

1. 3　HPV检测和基因分型　HPV基因型检测步骤是: (1)样本DNA提取:取样本0. 5ml, 13 000g离心15min弃上清。用Q IAMin试剂盒(Q IAGEN)萃取DNA; (2) PCR 扩增: 将PCR反应试剂及DNATaq酶按比例混合后每一反应管加入20μl,再加入DNA模板5μl,混合后扩增PCR,每一批次同时扩增HPV18亚型阳性对照和阴性对照各1 份; ( 3)导流杂交:凯普医用核酸分子快速杂交仪及配套试剂盒由北京仕基辰源公司提供。在杂交平台上放入标记有6, 11, 42, 43, 44,16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, CP8304等21种探针的低密度基因芯片,一次同时检测15份样本。按试剂盒说明进行导流杂交,酶标显色; (4)结果判断:肉眼观察检测结果,阳性呈蓝紫色圆点,根据芯片上HPV亚型相应的分布点判别HPV亚型。

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1. 4　高危型和低危型HPV组的判断标准　用Munoz等的HPV流行病学分类方法为检测到的HPV 亚型分类[3]。高危型HPV亚型包括HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56,58, 59, 68, 26, 53, 66, 73 和82。低危型HPV 亚型包括HPV6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 ( CP8304 ) 和CP6108。检测到的HPV亚型不在上述范围内定为“其他”。

2　结　果

2. 1　HPV临床感染率及亚型分布情况　189例患者中,正常63例, C INⅠ 38例, C INⅡ 44例, CINⅢ28例,宫颈癌(包括鳞癌和腺癌) 16例。HPV总感染率56. 1％ ( 106 /189) 。正常宫颈组织中HPV 感染率19％ ( 12 /63 ) , 检测到的HPV 亚型主要是HPV52, 58, 53, 16和33 (其中HPV16, 33, 31, 66 检出率一致) 。C IN Ⅰ患者HPV 感染率57. 9％ ( 22 /38) ,最常见的HPV亚型为HPV52,其次为HPV58,16, 33和18 (其中HPV18, 31, 53检出率一致) 。C INⅡ患者HPV感染率70. 5％ (31 /44) ,以HPV52, 16,58, 33和18等亚型最常见(其中HPV18, 53检出率
一致) 。CIN Ⅲ患者HPV 感染率89. 3％ ( 25 /28 ) ,HPV 亚型以HPV16, 52, 58, 31, 33 为主(其中HPV31, 33检出率一致) 。宫颈癌患者HPV阳性率为100％ ( 16 /16 ) , HPV16 检测率最高, 其次为HPV18, 52, 58和33,见表1（略）。由表1可见,从亚临床感染到宫颈癌的发病过程中,高危型HPV感染率逐渐增加,低危型逐渐减少,宫颈癌患者中甚至未检测出低危型HPV。最常见的高危型HPV 亚型是HPV16,其次为HPV52, 58, 33 和18。HPV16 随宫颈病变程度增高阳性率增加,且宫颈癌中的检出率显著高于其他亚型。HPV18 阳性率亦与病变程度呈正相关,虽然HPV18在正常者和CIN患者中检出率较HPV52 和58 低,但在宫颈癌中却居第二位。HPV52和58阳性率随宫颈病变加重总体呈上升趋势, 正常者和CIN Ⅰ/Ⅱ者中检出率甚至超过HPV16, 但在宫颈癌中阳性率有一定的回落。HPV33阳性率变化趋势基本与HPV52, 58一致,在宫颈癌中检出率与HPV58并列第4。

2. 2　HPV亚型的复合感染　本研究中, HPV复合感染率22. 6％ (24 /106) ,其中正常者中复合感染率16. 7％ ( 2 /12 ) , CIN Ⅰ患者和CIN Ⅱ患者分别是22. 7％ (5 /22)和25. 8％ (8 /31) , C INⅢ患者和宫颈癌患者的复合感染率分别是32. 0％ (8 /25)和6. 3％(1 /16) ,见表2。我们用感染人次比来反映各组HPV感染情况,并发现C INⅢ患者中感染人次比最高,达1. 7 ( 43 /25 ) ;其次是CIN Ⅱ患者为1. 5 ( 47 /31)和C INⅠ患者为1. 4 ( 31 /22) ;宫颈癌患者的感染人次比最低,为1. 1 ( 17 /16) ;正常者为1. 3 ( 15 /12) 。提示随宫颈病变程度增加,多重感染比例有逐渐上升的趋势,但宫颈癌组除外。

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3　讨　论

　　目前几乎所有的流行病学调查结果与生物学资料都证明,高危型HPV持续性感染是宫颈病变发展
为C INⅡ/Ⅲ或更为严重疾病的必要条件。HPV流行病学研究已深入到各年龄段人群,包括老年人和
儿童。然而, HPV具有明显的种属特异性,它们不能在动物体内感染,也不能体外细胞培养,亦不能用血清学行流行病学调查,因为生殖道感染往往在血清学上无表现[4] 。因此,利用宫颈刮片或脱落细胞学检测HPV2DNA尤为重要。本研究用凯普导流杂交基因芯片技术评估了21种HPV亚型在不同宫颈病变中的分布特点。受检189 例患者中, 21 种HPV 亚型全部检出,其中HPV16, 18, 33, 52和58是最常见的基因型,与文献报道基本一致[5, 6] 。Clifford等[7]在85项研究10 058例宫颈癌患者HPV 分型研究中, Meta 分析表明HPV16, 18, 45, 31, 33, 58, 52是宫颈癌患者中最常见的感染亚型,其中亚洲地区HPV58, 52型感染率远高于45, 31, 33型,支持本研究结果。

　　不同的HPV亚型在不同的宫颈病变中的流行率不仅依赖于感染阶段的发病率,且与它们在宫颈
上皮的转化能力有关。HPV16具有完全的细胞转化功能和致瘤性。研究表明, HPV16在宫颈癌组织中检出率最高[3, 5 - 7] ,与本研究相符。虽然HPV52, 58在本研究宫颈癌前病变中阳性率逐渐上升,但是,宫颈癌中的检出率相对回落,提示HPV52, 58 在CINⅡ/Ⅲ发展为宫颈癌过程中, 自然清除速度较快。HPV52中E6 /E7基因被认为具有限制细胞转化的能力,并且很少整合到宫颈癌宿主染色体上[8] ,与其他高危型HPV 亚型相比, HPV52 的致瘤性相对较弱。Lai等[9]认为, HPV58 主要存在于老年宫颈癌患者中,且预后较宫颈癌HPV16 和(或) HPV18 阳性者好。

　　CIN Ⅱ/Ⅲ和宫颈癌患者差异最显著的是HPV18亚型(2. 1～2. 6倍) 。一项纵向随访研究结
果表明, HPV18 与意义未明的不典型鳞状细胞( a2typ ical squamous cells of undetermined significance,ASCUS)和C INⅠ的风险相当,但是发展为CINⅡ/Ⅲ的风险较小[10] 。交叉学科研究也表明, HPV18 在C INⅡ/Ⅲ者检测不常见。虽然其确切的机制尚不明确,但有理论提出, HPV18亚型在CIN Ⅱ/Ⅲ感染阶段比较短暂且进展较快。HPV18相关的宫颈癌通常以整合形式存在宿主细胞中,具有高E6 /E7 表达性,而其他HPV 亚型则以整合和游离两种形式存在。Ding等提出, HPV18主要感染鳞柱状交界处的柱状上皮,因此很少发展为C IN Ⅱ/Ⅲ,但具有发展为宫颈腺癌和鳞癌的双向潜能[1] 。他们的研究证实了这一点。

　　在检测HPV亚型的过程中,我们发现不少患者存在复合感染,以CIN Ⅱ/Ⅲ患者复合感染最明显,
感染率达25. 8％和32. 0％。以二重感染和三重感染最常见, 二重感染以HPV16 + 33, HPV16 + 18,HPV52 + 58为代表,三重感染以HPV16和52亚型多见。复合感染患者均至少同时感染一种高危型HPV。有报道指出,多种HPV复合感染占总HPV感染的20％～30％ ,与单个HPV感染相比,增加了发生癌前病变的风险。Inoue等[11]认为, C IN常与多重感染相关,而宫颈癌则以单一感染多见,与本研究结果一致。目前对多重感染是否具有更严重的致瘤性学术界尚无统一观点。Fife等[12]认为,多重感染者发展为癌的危险性较单一感染者大。Gargiulo等[13]报道,高危型HPV多重感染并不比单一感染能更好地预测宫颈高度上皮内瘤变。他们的研究表明,虽然多重HPV感染在CIN和宫颈癌患者中占有一定比例,但主要以单一感染为主。即使是多重感染,也多以某一单一型感染为主,其他亚型对宫颈病变的作用并不突出,尤其是宫颈癌表现的更为特殊。这与癌症单克隆起源的科学证据一致。此外,有文章指出,宫颈癌发生的必要条件是HPV持续性感染,但是多重HPV感染不一定产生持续性感染[14] 。

　　陶萍萍等对凯普导流杂交方法进行了评估,发现导流杂交技术与hc22法的符合率为92. 5％ ,一致性极好( Kappa指数> 0. 75) ,并认为导流杂交技术更具优越性[5] 。同时, HPV导流杂交与细胞学检测方法相比具有更高的敏感性和阳性预测值[11] 。郎景和指出,对HPV感染的检测和分型是处理宫颈病变的重要依据,也是宫颈癌筛查中不可或缺的内容。若受检者连续两次宫颈分泌物HPV检测阴性,其筛查间隔时间可延长至5～8年,与细胞学的间隔时间3 年相比, 明显减轻了受检者的精神和经济负担[15, 16] 。研究表明, HPV2DNA检测与细胞学联合筛查宫颈病变具有高效性[11, 17] ,两者结合的宫颈癌全面筛查方案有望取代单一的细胞学检测。

　　本研究结果不论是HPV感染率( 56. 1％ )还是宫颈癌发生率(8. 5％ )都较高,可能与病例选择、检测方法、门诊高危患者较集中有关。正常者、C INⅠ、CINⅡ、CINⅢ患者和宫颈癌患者中HPV的感染率分别为19. 1％ , 57. 9％ , 70. 5％ , 89. 3％和100％ ,提示随着宫颈病变加重HPV感染率显著升高。这更加证实HPV 感染与宫颈癌变密切关联。由于80％HPV感染可在8～12月内自然清除,且C INⅠ可作为HPV感染的暂时性病变,它并非是CIN Ⅱ/Ⅲ及宫颈癌必要的前驱表现(但一般认为CIN Ⅱ/Ⅲ 是宫颈癌的必要感染阶段) ,本研究中正常者和CINⅠ患者的临床转归如何(包括HPV亚型变化情况及宫颈疾病进展程度)有待进一步随访。此外,本研究只是初步探讨了女性下生殖道HPV常见的基因亚型,未进一步探讨年龄相关的HPV亚型分布情况,且未对受检者HPV感染相关因素进行分析,如吸烟,初次性交年龄,性伴侣数,产次等,有待今后积累更多的样本量进行综合统计分析.

参考文献：略