作者：

Yijun Song M.D., Ph.D.1, Congcong Liu M.D.2, Hong Qi M.D., Ph.D.2, Yunping Zhang M.D.2, Xuming Bian M.D.1, and Juntao Liu M.D., Ph.D.1*

1 中国协和医科大学 北京协和医院妇产科

2 海淀区妇幼保健院妇产科，

*通讯作者：刘俊涛，中国协和医科大学 北京协和医院妇产科

 

摘要：

目的：基于母血浆游离DNA的大规模平行测序技术（non-invasive prenatal test, NIPT）在以往的研究中已经被证实可作为一种新型的产前筛查方法加以运用。但是之前的研究主要集中于高风险和高龄人群，尚缺乏低龄人群（<35岁）中的研究结果。本文的研究目的便是在中国低龄孕妇群体（<35岁）中开展NIPT针对染色体非整倍体疾病的前瞻性研究。

方法：利用大规模平行测序的方法检测母血浆DNA。检测结果需与血清学筛查结果对照，且通过核型分析和产后随访验证。

结果：本研究共收集1,916例门诊随机样本，其中73例（3.8%）样本未通过测序前的质控，111例（5.8%）样本未有妊娠结局随访结果，最终可用于分析的有效样本数为1,741例。本次研究NIPT共发现15例染色体非整倍体样本，包含T21、T18和T13。在性染色体非整倍体检测方面，NIPT检出4例异常中的2例，特异性99.88%。

结论：与中孕期血清学三联筛查相比，NIPT具有很高的灵敏度和特异性，同时还具有很低的假阳性率，可以在低龄孕妇（<35岁）中应用。

关键词：染色体非整倍体，cffDNA，NIPT，大规模平行测序

 

 

背景介绍：

染色体非整倍体疾病是一类主要的遗传性疾病。新生儿中最为常见的染色体非整倍体疾病为21三体综合征（唐氏综合征，T21）、18三体综合征（爱德华氏综合征，T18）、13三体综合征（帕陶氏氏综合征，T13）和性染色体非整倍体疾病。有数据显示，T21的发病率为1/80011，发病率随孕妇年龄的增加而增加，当孕妇年龄达到45岁，T21的发病率增加到1/3523,29。T18和T13各自的发病率为1/6000和1/1000017，性染色体非整倍体疾病在新生儿中的发病率约为1/50024。

近几年，用于染色体非整倍体疾病的产前检测方法取得了长足进步。基于孕妇年龄的血清学三联筛查更是发展迅速，对于T21的检出率已达到70%1。胎儿颈项透明带（NT）的配合应用更可显著提高染色体非整倍体疾病的检测灵敏度。研究发现，早孕期和中孕期的血清学筛查联合运用，T21的检出率可达到80%21，若进一步结合NT，T21的检出率可高达96%21。不过，血清学筛查假阳性率约为5%，且筛查人群大时工作量巨大，也仅适用于T21或T18，对于其他染色体非整倍体不能取得T21或T18类似的检测效力。

基于母血浆游离DNA的NIPT检测技术开启了产前筛查的新时代。最初的研究主要集中在NIPT对于T21的检测效力上9,14，随后扩展至对于T18和T13的检测6,30,32。一系列的临床研究证实NIPT对于T21、T18的检测灵敏度可达到99%以上，T13的检测灵敏度介于78.6%与91.7%之间，假阳性率低于1%4,5,8,10,12,25-28,31,34，但对于性染色体非整倍体的NIPT检测很少报道，其中一项研究取得了93.8%的检测灵敏度4。

不过上述NIPT的研究主要集中于高风险和高龄孕妇（≥35岁），且本质上为回顾性研究。在过去几年间，NIPT已经作为一项产前筛查技术向高风险和高龄孕妇推荐，NIPT检测阳性孕妇后续仍需进行侵入性产前诊断。不过目前仍缺乏一项前瞻性的临床研究评价NIPT在低龄孕妇（<35岁）中的检测效果。

 

方法

研究方案

在取得相关医院审查委员会认可的前提下，本研究预计收集来自北京协和医院和海淀区妇幼保健院至少2,000例的低龄孕妇（<35岁）单胎样本。所有受检孕妇均需进行中孕期血清学三联筛查。血清学筛查高风险（T21/T18高风险）、超声检测异常或曾经具有染色体疾病患儿生育史的孕妇需在知情同意的基础上进行侵入性产前诊断。所有受检孕妇在选择接受本研究时均需签署书面的知情文件，研究中采集孕妇5ml外周血，不重复抽血。所有外周血样采集后需立即送至北京贝瑞和康生物技术有限公司（Berry Genomics Co, Ltd.）进行大规模平行测序检测，检测周期10个工作日。本研究为双盲检测，测序前均对样本的血清学筛查结果和核型分析结果保密，研究结束时才将血清学筛查、核型分析、测序结果揭盲，进而分析三种检测结果。不过，对于测序结果为染色体异常（阳性）样本需立即揭盲。未有核型分析结果的样本后续电话或上门随访，随访需了解新生儿的各项体格评估结果等妊娠结局细节。

 

样品采集

所有外周血样本均采集自北京协和医院和海淀区妇幼保健院，采样时间4/26/2011 至12/13/2011。

 

血清学筛查

所有受检孕妇均需采集5ml外周血进行中孕期血清学三联筛查。血样采集和血清学筛查均在北京协和医院和海淀区妇幼保健院经国家卫生部审核通过的实验室内完成。血清学筛查平台采用AutoDELFIA分析系统（PerkinElmer公司，芬兰）完成对于孕妇血清AFP、β-hCG、uE3的检测，而后LifeCycle软件（PerkinElmer公司，芬兰）完成对胎儿T21、T18的风险值计算。筛查结果的cut-off值设定为1/270，筛查阳性样本需进行后续的侵入性产前诊断。

 

侵入性产前诊断

本研究中的血清学筛查高风险、超声检测异常、染色体疾病患儿生育史、NIPT检测阳性的孕妇均建议在北京协和医院进行侵入性产前诊断。侵入性产前诊断包括绒毛膜取样（CVS）、羊水穿刺和脐带血穿刺。侵入性方法采集的绒毛、羊水等需经细胞培养后进行核型分析。核型分析采用400条带的G显带技术。对于染色体嵌合体样本的分析参照Hsu和Benn的指导流程18。染色体异常胎儿的妊娠终止需孕妇自愿。

 

母血浆DNA处理和测序

采集5ml母体外周血至EDTA抗凝管（Becton Dickenson公司，美国）中，采血后6小时之内分离血浆。使用QIAamp Circulating Nucleic Acid试剂盒（Qiagen公司，德国）提取血浆DNA，而后利用改进的ChIP Seq流程进行测序文库制备9。上机测序前，文库DNA需连接上6bp的index标签序列，且用Kapa SYBR fast qPCR试剂盒（Kapa Biosystems，美国）进行DNA定量。11个待测样本，连同1个对照样本共同上样在一张flow cell的一条泳道上，Illumina HiSeq2000测序平台进行测序，测序流程参照Illumina的43bp单端标准测序流程。NIPT测序质控的详细信息请参照附表。

 

测序数据分析

每个测序样本通过独有的index标签序列进行区分，测序结果借助BWA数据库19与人类的参考基因组（hg19）进行比对。73例样本（3.8%）未通过测序前的质控，剩下的1,843例样本正常测序，计算比对到每条染色体上的DNA序列数目和GC含量。用作对照的样本来自某次回顾性研究中随机抽取的50例核型分析正常的女性二倍体样本20。

对于每个样品的每条染色体，我们计算GC矫正过NCRgc值20，通过Z检验的方法确认样本是否存在染色体异常8,9,20。

 

结果

本研究共收集1,916例单胎样本，其中111例（5.8%）未有妊娠结局随访结果，73例（3.8%）未通过测序前的质控，未通过质控的64例样本具有妊娠结局随访结果，因而，本次研究的有效样本数为1,741例（图1）。

表1简要描述了1,741例样本的基本情况。受检孕妇的平均年龄为29.03±2.70岁，采样时的孕周跨度为11-21孕周，平均孕周为16.57±1.56周。

1,741名低龄孕妇进行中孕期血清学三联筛查，其中249名筛查结果高风险，阳性率14.3%。血清学筛查高风险的孕妇中，246名孕妇为T21高风险，3例为T18高风险（图1）。

与血清学筛查同时进行的是母血浆游离DNA大规模测序，但测序前需对孕妇的临床信息保密。1,916例样品中，73例（3.8%）样本未通过测序前的质控：48例DNA质控不合格，25例测序质控不合格。我们计算完成测序的1,741例样本的Z检验值，cut-off值设定为3，检测到15例染色体非整倍体样本：8例T21，3例T18，1例T13，2例45X，和1例XXY，检测阳性率0.86%（15/1,741）。15例NIPT阳性样本后续均进行侵入性产前诊断。

我们总共对需要产前诊断确诊的275名孕妇中的202名（73.5%）进行了侵入性的产前诊断。这202名孕妇包括178名唐筛高风险孕妇（178/249），和24名其他异常孕妇（包括10名NT检测异常者，见图1和附表S1）。侵入性产前诊断方法包括绒毛膜取样、羊水穿刺和脐带血穿刺（结果见表格S2）。侵入性产前诊断共发现染色体非整倍体样本15例，包括8例T21，2例T18，1例T13，4例45X（含1例45X嵌合）。核型分析同时发现了4例额外的染色体结构异常样本（见表格S3）。所有19名核型分析异常的孕妇最终选择了终止妊娠。

我们跟踪随访了1,916名受检者中的1,805名（随访率94,2%），除上述提及的19名核型分析异常孕妇选择终止妊娠外，其他新生儿均未发现存在任何与染色体非整倍体疾病相关的外观特征，因而我们推断这1,805名孕妇中仅存在15名染色体非整倍体疾病患儿。

本研究为双盲试验，我们以核型分析为金标准，比较了中孕期血清学三联筛查和NIPT在检测染色体非整倍体方面的效力。核型分析阳性或NIPT检测阳性的样本汇总在表2中。核型分析检出了11例T21/T18/T13样本（阳性率0.63%）。NIPT检出了12例T21/T18/T13样本，其中11例完全与核型分析结果吻合（包括1例核型结果为T21罗伯逊易位患者）。另有1例核型分析正常但NIPT检测T18阳性的样本，后通过母血核型分析发现，母亲核型46,XX[47]/47,XX,+18[3]，为T18嵌合体。对于T21、T18、T13的中孕期血清学三联筛查与NIPT检测结果对比在表3中列出。本研究中， NIPT对三大染色体非整倍体的检测灵敏度100%（11/11, 95% CI: 67.86% to 100%），特异性99.94%（1,729/1,730, 95% CI: 99.63% to 99.99%），阳性预测值91.67%（11/12）。11例T21、T18、T13样本中，6例被血清学筛查检出，5例被血清学筛查漏掉。血清学筛查对于T21、T18、T13的检测灵敏度54.55%（6/11, 95% CI: 24.56% to 81.86%），特异性85.95%（1,487/1,730, 95% CI: 84.21% to 87.54%），阳性预测值2.41%(6/249)。

我们又进一步评价了NIPT在检测21号、18号、13号以外的其他染色体非整倍体方面的效力。核型分析结果显示，除上述11例T21、T18、T13外，仍存在4例45X(含1例45X嵌合)。NIPT检出2例45X和1例XXY，其中XXY后经核型分析证实为正常样本。汇总可知，NIPT检出2例45X样本，漏掉2例45X（包含1例45X嵌合），另存在1例XXY的假阳性。

总结上述结果，若将未通过质控的阳性样本排除在外，NIPT总共检测发现了15例染色体非整倍体样本，其中13例与核型分析结果吻合。NIPT对五大染色体非整倍体的检测灵敏度86.67% （13/15, 95% CI: 58.40% to 97.66%），特异性99.88% （1,724/1,726, 95% CI: 99.53%to 99.98%），阳性预测值86.67%（13/15）（见表4）。NIPT对于各条染色体检测的灵敏度和特异性也在表5列出。

 

讨论

NIPT在产前检测方面发展迅速，已取得十分可喜的临床研究成果2，但之前的研究大多为回顾性试验设计，且受检人群多为高风险和高龄人群。最近的一项回顾性研究显示，使用目标染色体测序的NIPT方法检测T21和T18，检测假阳性率可低至0.1%25。为了进一步评价NIPT在低龄孕妇（<35岁）中的检测效力，我们设计了本次前瞻性研究，评判NIPT的实验成功率，染色体非整倍体疾病的检测灵敏度、特异性、假阳性率等。

本研究的局限性之一在于我们仅比较了NIPT和中孕期血清学三联筛查的检测效能，原因在于中孕期的血清学三联筛查为目前中国的主要筛查模式。后续，进一步的研究仍需在普通人群中评估NIPT与其他筛查模式的检测效能，如早孕期筛查、中孕期四联筛查等。同样，经济利益也是后续需要评估的一个方面。在中国NIPT目前的花费显著高于其他血清学筛查，此次我们虽未加评估，但未来却是不可缺少的一个方面。

本研究另一个局限性在于实验失败率3.8%，与其他NIPT研究小组的实验失败率相当12,25,28,34。血浆游离DNA含量不足是实验失败的主要原因。在整个实验过程中，我们仅采血一次，每次采集5ml，采血后6小时之内进行血浆分离，1ml分离的血浆用于后续的DNA提取和上机测序。

本次研究还有另一个潜在的缺陷，在于妊娠结局随访采用的是新生儿外观特征检查的方法，而非对所有新生儿进行核型分析确认。不过这一缺陷也是所有前瞻性临床研究所不可避免的。

本研究中血清学筛查阳性率为14.3%，显著高于医院常规5%的阳性率，我们分析原因是此项研究吸引了许多早孕期筛查高风险的孕妇加入。不过，由于胎儿染色体非整倍体较低的发生率（本次研究为0.63%），因而并没有显著影响我们的检测结果。

NIPT对于T21、T18、T13具有很高的检测灵敏度和特异性。本研究NIPT对上述三大染色体非整倍体疾病的检测灵敏度为100%，假阳性率0.06%，这与之前研究公布的结果一致。与血清学筛查相比，NIPT更灵敏（100% vs. 54.55%），更特异（99.94% vs. 85.95%），阳性预测值更高（91.67% vs. 2.41%）。

除T21、T18、T13外，我们又进一步评价了NIPT在其他染色体非整倍体方面的检测效力。在性染色体检测方面，NIPT并不能取得与T21、T18、T13相仿的高检测准确率。ISPD也曾对NIPT在性染色体非整倍体方面的应用发表指导意见3。已经被证实，母体血浆cffDNA来自于胎盘7,22，而非胎儿，临床上也已经发现胎盘细胞和胎儿细胞遗传信息不符的情况，以限制性胎盘嵌合（CPM）为例，CPM在性染色体异常方面便较为常见15。Faas等人在最近的一项研究中发现NIPT检测结果与滋养层细胞的45X一致，而非胎儿的46XX13。NIPT对性染色体低的检测灵敏度和特异性也间接体现了胎盘和胎儿遗传信息可能不符的现象。

本研究中的假阳性率为0.12%，与之前研究公布的结果一致。即使如此低的假阳性率，对于NIPT检测阳性的样本后续仍需进行侵入性产前诊断。1,741例样本中，我们发现2例假阳性（1例T18和1例XXY），后续证实T18假阳性是由于母亲为T18嵌合体而引起。我们怀疑XXY假阳性样本存在胎盘和胎儿遗传信息不符的现象。

 

结论

目前NIPT已经作为一项新型的产前筛查技术向高龄或高风险孕妇推荐。我们的研究证实在低龄孕妇（＜35岁）中，NIPT仍能取得与高龄、高风险孕妇相似的检测效力。本次研究NIPT对T21、T18、T13三大染色体非整倍体疾病的检测灵敏度100%（95% CI: 67.86% to 100%），假阳性率0.06%，灵敏度和特异性显著高于中孕期血清学三联筛查。我们有理由推测，基于高通量测序的NIPT技术在未来也可在低龄孕妇（＜35岁）中应用。

致谢

对于参加本次研究的所有受检者我们致以诚挚的谢意。

 

 

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