在人类辅助生殖技术（包括IVF和ICSI）中，胚胎早期发育均是在体外环境中进行的，大气氧培养系统（单气培养箱、氧浓度20%）是临床上最多被采用的胚胎培养方式。然而，大部分哺乳动物输卵管和子宫的氧分压在2%~8%之间，从输卵管到子宫逐渐降低[1]，人类宫腔内氧分压大约为2%[2]。因此目前三气培养系统(5%氧气浓度)逐渐被临床所接受并应用于囊胚培养（胚胎发育4~6天），然而对于早期低氧环境（胚胎发育0~3天）是否对IVF/ICSI结局具有有利影响，目前尚无定论。本研究回顾性分析了本中心2015年1月—2016年6月接受IVF或ICSI治疗的患者，统计了0~3天在大气氧培养与在低氧环境下培养的胚胎发育状况和临床结局，为改善人类胚胎的体外培养体系提供参考资料。

1 材料与方法

1.1  研究对象与分组

回顾性分析了邢台不孕不育专科医院生殖中心2015年1月—2016年6月在我院行IVF或ICSI治疗的周期，共1131个周期。所有胚胎囊胚培养期（4~6天）均低氧（5%O2浓度）培养，根据0~3天培养的氧浓度将其分成两组：2015年12月8日—2016年6月30日胚胎发育0~3天在三气培养箱（5%O2浓度）为早期低氧培养组，共342例；2015年1月—2015年12月7日胚胎发育0~3天在单气培养箱培养（20%O2浓度）为早期大气氧培养组，共789例。


1.2 卵母细胞获取

应用常规长方案、微刺激方案促排卵或自然周期取卵，B超监测卵泡发育，待卵泡长大成熟后，当晚肌肉注射HCG（微刺激方案为达菲林），37h（微刺激为35h）左右行超声引导下卵泡穿刺取卵术。


1.3 受精

取卵当日手淫取精获取精液或解冻精子，根据患者病情行常规IVF或ICSI方式授精。IVF: 取卵后 4±h 体外受精， 调节精子受精密度为 20000/每个卵母细胞，受精后4~6h拆除卵子周围颗粒细胞，若出现不受精情况，进行早补救ICSI。ICSI: 取卵后4~6h选择有极体的分裂中期( MⅡ) 卵子进行显微注射。


1.4 胚胎培养

受精后18～22 h后倒置显微镜下观察受精情况，并记录原核（PN）数目：2PN为正常受精；D2和受精后D3评估卵裂期胚胎形态，记录胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀，移植或冷冻胚胎选择主要依据D3胚胎形态，在此基础上综合考虑原核期和D2胚胎形态，其余胚胎培养。


1.5 胚胎形态学评分

在受精后第 3 天，根据每一个胚胎的卵裂球数目、大小和碎片等情况进行形态学评分:Ⅰ级，卵裂球大小均匀，形态规则，胞质均匀清晰，无碎片或＜10%；Ⅱ级，卵裂球大小均匀或略不均匀，形态欠规则，无碎片或10-20%；Ⅲ级，卵裂球大小不均，形态欠规则，碎片20-50%；Ⅳ级，卵裂球大小严重不均，碎片＞50%。其中级别在Ⅲ级及以上的胚胎为可用胚。


1.6 评价指标

2PN可用胚率=2PN可用胚数/2PN卵裂数；可用囊胚形成率=可用囊胚数/养囊胚胚胎数；妊娠率=妊娠患者数/移植患者数；种植率=种植胚胎数/移植胚胎数。


1.7 统计学分析

数据用平均数±标准差表示, 采用SAS软件对数据进行分析。组间均数的比较采用t检验, 率的比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。


2  结果

2.1  两组患者基本资料

两组患者的年龄和获卵数均无统计学差异（P＞0.05），详见表1。


2.2 两组患者的胚胎发育及临床结局比较

早期低氧培养组的2PN可用胚率和可用囊胚形成率显著高于早期大气氧培养组，差异极显著（P＜0.01），与早期大气氧培养组相比，早期低氧培养组妊娠率和种植率虽均无显著差异，但从数据来看早期低氧培养组均有明显增高的趋势，详见表2。



3   讨论

人类辅助生殖周期如IVF和ICSI中，传统的单气胚胎培养箱中20%氧浓度被认为可能产生对胚胎有害的物质如活性氧（ROS）包括超氧阴离子基团 (O2-)，过氧化氢 (H2O2) 和羟自由基 (OH)[3-4]，导致DNA损伤、线粒体改变、脂质过氧化或蛋白质的氧化改变等等[5]，其不良影响在多种动物实验包括小鼠、猪、牛等已被证实。

有关人类胚胎培养氧浓度影响的研究结果并不一致。有些研究显示降低氧浓度 (5%)未能显著提高胚胎的质量、着床率和妊娠率。Dumoulin等没有发现低氧相对于高氧对于胚胎发育和临床结局存在优势。Krea等报道虽然第3天胚胎发育评分低氧环境更好但临床指标包括植入率和妊娠率均没有改善[7]。 2011年Gomes Sobrinho等的Meta分析对胚胎受精率、妊娠结局分析指出，虽然有一些关于低氧浓度培养有益的报道，但目前还没有证据证明低氧浓度是必须的，得出低氧浓度有助于 IVF 结局的结论还为时尚早，仍需要进一步的随机对照试验来证明[9]。但也有研究显示低氧浓度可以提高临床妊娠率和出生率[6-8]。2012 年来自 Bontekoe等人的系统综述显示低氧浓度可以提高 IVF 的出生率，但其纳入的研究方法学质量较低，仍需更多高质量的研究来证实[10]。多数囊胚培养及移植周期研究认为低氧培养环境有利于囊胚发育和提高临床妊娠率。Petersen等[11]发现低氧环境中解冻的人类卵裂期胚胎囊胚形成率增加。Dumoulin[12]等继续培养D3移植后废弃的人类胚胎结果在低氧环境中得到的囊胚细胞数显著高于高氧环境。在一些动物研究如大鼠试验中发现低氧与高氧培养的胚胎桑葚胚和囊胚的发生率及形态学虽然无差异，但低氧培养的胚胎内细胞团数目和着床率显著高于正常氧浓度组[13]。Kovacic等[14]的研究结果显示低氧胚胎培养周期的累积临床妊娠率明显提高，并且低氧组反应不良亚组胚胎移植的临床结局也显著提高，提示低氧或许可以挽救一部分本身来源有缺陷而对外环境适应性差的胚胎使其发育达到可以冷冻和继续培养的标准。杨羽等[15]的研究结果显示低氧培养条件下可用胚胎增加，周期累积妊娠率提高且在预后差的病人中使用低氧培养环境提高了胚胎种植率。

胚胎在早期阶段暴露于高氧浓度环境可能会对胚胎后期产生一定的负面影响，从而影响临床结局[16][17]。Nanassy等[18]研究显示在D1~2时应用大气氧浓度培养胚胎，在D3~5时应用低氧浓度培养，与一直于常氧浓度培养胚胎相比，并未提高其种植率妊娠率或囊胚形成率。该研究认为虽然在胚胎发育后期应用低氧浓度培养胚胎，但无法弥补早期高氧浓度造成的损害，因此在胚胎早期低氧培养是有必要的。在本研究中，D0~3低氧培养组的妊娠率和种植率与D0~3大气氧培养组虽然没有显著差异，但有明显增高的趋势，且2PN可用胚率和可用囊胚形成率显著高于早期大气氧培养组（P＜0.01），表明早期低氧培养对于胚胎发育及妊娠结局是非常重要的。但由于本研究属于回顾性分析，两组的患者并没有随机分配，因此两组可能会有操作及方案上的细微差别，这或许会对研究结果有一定的影响。且目前这些研究都只关注于形态学和着床情况，今后的研究可以更多关注其他的潜能指标，如氧浓度导致基因表达的改变［19］。

综上所述，胚胎早期（0~3天）低氧培养（5%氧气浓度）能够显著增加2PN可用胚率和可用囊胚形成率，提高胚胎的发育潜能，并在一定程度上提高胚胎的妊娠率和种植率。但进一步的确切结果仍有待于更多大规模长期多中心的随机对照研究，纳入系统综述，进行累计、meta分析，以更加明确低氧浓度培养对胚胎发育及临床结局的影响和安全性。

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【作者简介】

作者简介：陶林林，女，邢台不孕不育专科医院（邢台生殖与遗传专科医院）生殖实验室技术员，检验师，从事生殖实验室工作多年，擅长实验室质量控制、IVF-ET、ICSI操作、胚胎移植、冷冻等多种实验室技术。2010年毕业于聊城大学生物科学本科专业，2013年毕业于华中农业大学胚胎工程硕士专业，曾多次参加辅助生殖及生殖内分泌研讨会及短期培训，与多名国家知名团队共同学习，研究不孕课题并在国内核心期刊发表论文多篇。




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