摘要    

孕期的各种应激刺激及临床上地塞米松等药物的广泛使用是导致胎儿暴露于内、外源性糖皮质激素的重要原因。女性(雌性)卵巢功能异常甚至疾病状态具有宫内起源，而糖皮质激素可能参与编程子代卵巢功能发育损伤甚至多代的功能异常。本综述结合临床和实验室的研究进展，系统概述内、外源性糖皮质激素导致子代卵巢发育损伤及其多代遗传的现象，并初步探讨其宫内编程机制。


【关键词】孕期糖皮质激素暴露；卵巢发育；宫内编程


基金项目：国家自然科学基金重点项目(81430089)；国家自然科学基金面上项目(81673524、81671472)

DOI：10.3760/cma.j.cn101441-20190701-00280.


女性生殖功能异常呈现增长趋势，这极大降低了其生活质量。有报道指出，女性(雌性)的生殖功能异常往往存在早期生命起源，并且会影响其后数代[1]。在大多数哺乳动物中，孕期母血和胎血糖皮质激素(glucocorticoid，GC)水平随着孕周逐步增加。这种生理性的GC改变对胎儿器官成熟、维持妊娠和分娩至关重要。然而，各种应激刺激包括感染、营养不良、焦虑和抑郁都会引起母亲内源性GC水平过度升高[2-3]；在临床上外源性GC(如地塞米松、倍他米松等)被广泛用于治疗先兆早产，这些因素都有可能引起胎儿暴露于GC，从而对胎儿产生一系列影响，其中包括成年后生殖功能异常[4]。卵巢作为雌性的生殖器官，其最重要的功能是排卵和分泌雌激素。多项研究指出，对于成年女性，雌二醇分泌异常[5]、卵泡数减少和生殖功能改变[6]等具有宫内起源。尽管学界对于女性(雌性)子代卵巢功能损伤宫内编程的探索有了一定的进展，但至今仍没有系统、完整的机制概括。本文将从内、外源性2个层面综述孕期GC暴露导致雌性子代卵巢发育异常的现象，并探讨其可能机制。


一、卵巢的结构与功能发育


卵巢是雌性个体的重要性腺器官，其主要功能是提供成熟的卵细胞和分泌性激素，在维持机体的正常生殖功能中发挥了重要作用。胚胎卵巢存在生殖细胞和体细胞，在出生后卵子发育成熟随月经周期排卵，参与哺乳动物的受精过程，维持女性(雌性)正常的生育功能；而胚胎卵巢体细胞又因其基因表达谱的不同可分成脉管相关细胞、一般体细胞和前颗粒细胞，前颗粒细胞分化为卵巢主要的内分泌细胞——颗粒细胞，后者合成的雌激素有抗卵泡闭锁、维持卵巢生长和支持卵母细胞成熟等作用，可影响个体的青春期到来，并决定原始卵泡池的数量。因此，胚胎时期的卵巢发育状态对其成年后卵巢生殖和内分泌功能的实现尤为重要。


二、GC对子代卵巢发育的影响


对于不同种属的动物，卵巢卵泡的形成处于不同时间窗，故孕期GC的暴露时间对子代卵巢功能的影响存在种属差别。在这部分，本文将结合流行病学和实验室研究，综述近年来GC导致子代卵巢发育异常的现象。


1. 内源性GC过暴露对子代卵巢发育的影响：应激状态下母体下丘脑-垂体-肾上腺轴被激活，从而产生过多的GC，这些GC通过胎盘影响着胚胎卵巢的发育。流行病学研究表明，母体营养应激对子代卵巢发育有着较为显著的影响，如宫内生长发育迟缓(intrauterine growth retardation，IUGR)的胎儿卵巢生长受损，其特征是卵巢皮质区的原始卵泡数量减少[7]。进一步的研究显示，与正常女性相比，IUGR个体出现青春期的时间提前了5~10个月，这些女孩也有较高的血卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)水平和较小的卵巢、子宫[8]。长期患有库欣氏综合征的孕妇，其胎儿在宫内处于应激状态，此时高水平的GC抑制了子代下丘脑-腺垂体-卵巢(hypothalamic-pituitary-ovarian，HPO)轴的调控信号，包括通过下丘脑抑制垂体促性腺激素的释放和对卵巢的直接抑制作用[9]。


动物实验同样也表明，孕期母亲营养限制使胎儿过多暴露于内源性GC[10]。羊的正常妊娠期约145 d，如果子代卵巢发育关键时期(50 d：减数分裂开始期；65 d：原始卵泡形成期；110 d：三级卵泡形成期)母羊处于营养不良的状态，则会在妊娠110 d观察到子代卵泡发育迟缓[11]。妊娠期间给小母牛饲喂低蛋白饮食，其后代青春期前卵泡更小，原始、初级卵泡、窦状卵泡的密度显著降低[12]，而这可能与孕期内源性GC过多暴露有关。在妊娠期间受到束缚或环境压力的雌性大鼠，其后代会出现受孕率降低和孕周减少[13]。从体外受精患者的卵泡中抽吸分离黄体颗粒细胞，将之暴露于一定浓度的皮质醇后检测上清中孕烯醇酮，发现皮质醇对类固醇合成的抑制作用呈浓度依赖性变化，提示GC对卵巢的内分泌功能有抑制作用[14]。


2. 外源性GC暴露对子代卵巢发育的影响：临床上外源性GC具有促进胎肺成熟的作用，广泛应用于早产风险的孕妇[15]。人群调查研究表明，在胎儿发育关键时期暴露于外源性GC，往往会导致胎儿低出生体质量，而在前瞻性研究中，出生体质量较低的女孩青春期提前并且更易出现胰岛素抵抗和卵巢高雄激素血症[16]。这很大程度提示了产前外源性GC使用的卵巢发育毒性。然而，至今缺乏明确的流行病学证据指向二者的直接关联，动物实验的开展为此提供了依据，却需要更多可受控的、前瞻性的长期随访研究来阐明这一假设。


动物实验表明，在大鼠孕13~23 d，每日注射0.25 μg/mL或1 μg/mL地塞米松，其雌性后代的青春期出现时间延迟[17]。这提示，胎儿暴露于GC是其青春期时间窗改变的一个重要决定因素。另一研究中，在Wistar大鼠孕16~18 d注射0.5 mg/kg地塞米松后，胚胎卵巢生殖细胞数目和卵巢体积均减小[18]。一项人体实验取孕8~11周的人类胎儿卵巢，用地塞米松(2 μmol/L、10 μmol/L或50 μmol/L)培养14 d后进行病理分析，结果显示地塞米松降低了生殖细胞的密度，其中高浓度下生殖细胞凋亡率显著增加[19]。这提示孕期合成类GC暴露可致子代卵巢形态和功能发育异常。


三、GC致子代卵巢发育损伤的宫内编程机制


1. GC对子代卵巢发育的直接影响：胎儿和母亲之间的物质交换必须经过胎盘，胎盘损伤会导致胎儿暴露于不良环境，从而影响其正常发育。2型11β-羟类固醇脱氢酶(type 2 11β-hydroxysteroid dehydrogenase，11β-HSD2)在胎盘中表达丰富，11β-HSD2主要是作为一种氧化酶，可将活性皮质醇/皮质酮转换为失活的可的松/11-脱氢皮质甾酮，从而保护胎儿免于过度暴露于皮质醇(在啮齿类动物为皮质酮)。前期研究证实，在妊娠时暴露于某些外源物可以抑制大鼠胎盘11β-HSD2表达，开放胎盘GC屏障，引起胎儿暴露于过量的母源性GC/合成类GC[20-21]。有关GC对卵巢的直接作用涉及局部调节因子、氧化应激和细胞凋亡三个方面。


（1）局部调节因子与卵巢发育损伤：已知胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1，IGF1)在卵巢细胞增殖和雌激素合成中发挥了调节作用，尤其针对发育期的原始卵泡，IGF1可显著增强FSH、黄体生成素(luteinizing hormone，LH)对颗粒细胞和膜细胞的增殖效应[22]。孕期乙醇暴露通过过度激活IGF1信号通路导致雌性子代大鼠出生后卵巢早衰的易感性增加[23]。GC能抑制IGF1的自分泌和(或)旁分泌，GC对IGF1轴编程也可能导致胎儿生长受限[24]。前期研究表明，孕期外源物暴露产生的后代，其血皮质酮水平显著升高的同时，血和组织(如肝脏、肾上腺)的IGF1水平显著降低[25-26]。这提示，孕期GC暴露可能会影响多种胎组织中IGF1的表达。本室研究也发现，孕期咖啡因暴露引起的胎血高GC能抑制IGF1及胚胎卵巢雌二醇合成功能(数据待发表)。鉴于IGF1可通过多种信号通路影响卵巢关键基因的表达，对于该靶点的研究可能会提供更多的方向。


在早期胚胎发育期间，类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1，SF1)作为一种孤核受体，其活性对性别分化和性腺形成至关重要。在胚胎阶段特异性敲除SF1后，雌性成年小鼠出现了不孕、卵巢缺乏黄体和出血性囊肿的症状。前期研究表明，孕期地塞米松暴露诱导了子代卵巢损伤的跨代遗传效应，其中卵巢SF1的持续低表达可能参与其中[6]。


（2） 氧化应激与卵巢发育损伤：孕期GC暴露能增加卵巢中氧化应激水平。活性氧(reactive oxygen species，ROS)作为一种信号转导分子，参与细胞的生理和病理过程。当细胞内ROS与抗氧化剂失衡时，过多的ROS会与脂类、蛋白和核酸发生作用，引起细胞凋亡和坏死，即氧化应激。研究已表明，氧化应激能引起多种卵巢相关疾病，如内分泌紊乱、卵巢早衰等，严重危害着人类和动物的生殖健康[27]。母体妊娠期间营养不良会上调胚胎卵巢中氧化应激水平，降低出生后代卵泡数量；在大鼠实验中，应激诱导产生的ROS超过生理水平(>80 ng/卵母细胞)，并可能导致卵泡卵母细胞的细胞周期阻滞和凋亡[28]；GC暴露可致人类卵巢生殖细胞密度降低，这可能与卵巢细胞氧化应激水平改变有关[29]。氧化应激可作为孕期GC暴露导致子代卵巢发育损伤的一个可能机制，但需要开展更多的基础研究来证实。


（3） 细胞凋亡与卵巢发育损伤：在关于GC与卵巢细胞凋亡的体外研究中，结果显示不同浓度的地塞米松对于卵巢细胞凋亡的作用表现不同。在人胚胎卵巢的体外培养中，地塞米松(10 μmol/L和50 μmol/L)能显著降低生殖细胞浓度，并增加了凋亡相关基因caspase 3的表达[19]。与此同时，人胚胎卵巢中早幼粒细胞白血病锌指蛋白(ZBTB16)表达增加而促细胞生存基因(KIT)表达水平降低，说明地塞米松很可能通过促进ZBTB16对KIT的抑制作用，导致胚胎卵巢细胞凋亡。然而，给予人卵泡液黄体颗粒细胞地塞米松(100 nmol/L)后，地塞米松可能通过影响Bcl-2的表达、缝隙连接的完整性和肌动蛋白的细胞骨架而抑制人黄体颗粒细胞凋亡[30]。因此，合成GC对卵巢细胞凋亡的影响取决于其暴露的浓度，这对于临床地塞米松的合理使用提供了更多的认识。


2. GC通过HPO轴对子代卵巢发育的影响：中枢神经系统对雌性生殖功能的精密调节是通过HPO轴信号反馈来实现的。孕期GC暴露会通过作用于胚胎HPO轴，从而影响性腺甾体激素合成和分泌。宫内尤其是孕晚期，下丘脑促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)神经元已经承担部分HPO轴调节功能。文献报道，孕期应激和外源性GC暴露会造成子代胎大脑发育损伤，其中包括下丘脑形态学和生殖功能改变[31]。研究表明，糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor, GR)高度表达于大鼠GnRH神经元[32]。在下丘脑神经元，地塞米松可通过GR抑制GnRH基因启动子区活性、表达及迁移能力[33]。孕期地塞米松暴露会影响胎鼠下丘脑GnRH神经元数量进而影响其成年生殖功能[34]。Kisspeptin系统包括kiss1编码的kisspeptin以及kiss1受体，对下丘脑神经内分泌功能产生重要的作用。孕期营养不良诱导的子代大鼠的阴道开口和动情周期延长，与下丘脑Kisspeptin的作用减少有关[35]，内源性GC过暴露可通过Kisspeptin系统影响雌性子代的卵巢功能。而在产前地塞米松暴露诱导的IUGR大鼠模型中，子代也出现了青春期延迟发作，但Kisspeptin系统的表达未发生变化[36]。由此可见，与内源性GC不同，外源性GC暴露是直接作用于GnRH神经元而对HPO轴产生抑制作用的。


四、表观遗传修饰与GC所致的卵巢发育异常


表观遗传修饰是指DNA序列不改变而基因表达改变的现象且具有可遗传性。然而，由于其遗传不稳定性，遗传决定的表观遗传机制对宫内不良环境十分敏感。机体在发育可塑期发生的表观遗传改变可以持续到成年期，也是成人疾病发育起源的致病机制之一[37]。


人类和动物模型研究显示，母体在孕期使用外源性GC[38]和孕期应激[37]会在后代DNA上留下表观遗传标记。而在卵巢的体内外研究中，孕期多种外源物暴露能导致子代卵巢某些基因的表观遗传修饰改变，如与受精和生殖发育相关的基因[39]、与雌激素合成相关的基因以及与颗粒细胞凋亡相关的基因[40]，或者导致卵巢表观遗传调节基因的变化[41]。芳香化酶是卵巢颗粒细胞中合成雌激素的关键限速酶，GC能够影响多种细胞中芳香化酶的表达[42-43]。本室研究表明，孕期咖啡因暴露导致的高GC可通过改变卵巢芳香化酶启动子区组蛋白乙酰化水平而影响其甾体合成功能(另文发表)。


当异常编程干预影响妊娠的F0代时，不仅直接影响其子代(F1代)，还会影响F1代的生殖细胞，即以后形成的F2代，甚至F3代[44]。有研究表明，妊娠期间母亲低蛋白饮食带来的内源性GC改变，其雌性后代的生殖功能改变。让人吃惊的是，雌性孙代也有早期卵巢储备功能衰竭，并伴随组织老化加速的特点[1]。提示GC导致子代卵巢功能受损存在多代遗传效应。越来越多的证据表明，表观遗传传递是早期环境调控多代效应的重要机制。妊娠晚期暴露于外源性GC，可导致F1和F2代豚鼠小脑、肝脏和肾上腺全基因组DNA甲基化减少[45]。本室的最新研究表明，孕期地塞米松暴露的F3代成年后仍存在与F1代相似的卵巢甾体合成功能抑制[6]，且其机制与生殖细胞中芳香化酶的表观遗传改变有关(数据待发表)。


五、研究展望


综上所述，孕期各种应激刺激引起的内源性GC过暴露或临床应用地塞米松造成的外源性GC暴露，可编程子代卵巢发育异常，这种异常的编程改变甚至会出现多代遗传效应。其发生机制总结如图1所示。然而，临床上合成类GC药物治疗(如地塞米松和倍他米松)对子代发育影响的研究并不多，实验室研究也不够深入，且欠缺相关机制研究。因不同种属的卵巢卵泡形成处于不同时间窗，故GC的暴露时间对研究不同暴露时间下子代卵巢功能的影响至关重要。孕期异常暴露的内、外源性GC可能穿过胎盘屏障局部作用于子代卵巢，也可能通过神经内分泌代谢编程的改变间接导致子代卵巢损伤，其中子代卵巢表观遗传修饰的变化扮演了重要的角色。因此，加强孕期GC编程子代卵巢损伤的研究，将为解释卵巢发育毒性的宫内起源及多代遗传效应提供了新的思路，也为评价临床上合成类GC治疗对子代生殖功能的影响提供了新的视角。

参考文献（略）