摘要： 随着现代医学科学技术的快速发展及人类生育力水平的下降，女性患者的生育力保护日益受到学界的广泛关注。在现有女性生育力保护的辅助生殖技术中，卵巢组织冷冻与移植技术经过不断完善与发展，已从一个实验性的技术变为临床应用逐渐增加的生育力保存方法。本文从卵巢组织冷冻的优势、卵巢组织冷冻与移植的技术难点、卵巢组织移植的安全性问题、未来的研究发展方向与应用等几个方面，对卵巢组织冷冻与移植技术的进展做一综述。


关键词： 卵巢组织冷冻；卵巢组织移植；生育力保存


随着科学技术的发展，辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）的应用越来越广泛，并且取得了很大的进展。然而，不孕不育仍然是困扰育龄人群正常生活的重要问题。目前，世界范围内的不孕不育率高达15%～20%。导致女性生育力下降的内因包括卵巢或卵发育异常、癌症等病变治疗导致的卵巢损伤的发生率增加、低龄化、治疗水平提高、长期生存率增加等[1-2]；导致生育力下降的外因包括社会压力增加、饮食结构改变、不恰当使用避孕节育措施、育年龄后延、环境污染、长期接触过量的放射物质、接触有毒物质的特殊职业者等。鉴于不孕不育对人口长期发展的影响，以及人类生育力近年来持续下降的趋势，生育功能逐渐降低正成为关系人类繁衍发展的社会重大问题，生育力保护也因此受到越来越多专家、学者的关注和重视，成为生殖医学领域备受关注的热点。


近年来，癌症早期诊断和治疗方法日趋进步，使得年轻癌症患者的死亡率大大降低。我国的恶性肿瘤发病和死亡统计结果显示：女性恶性肿瘤发病率在20岁以前处于较低水平，而到育龄期（20～40岁）之后随着年龄的增加快速升高，其中女性乳腺癌的发病率近年来呈上升趋势，乳腺癌已成为我国第二大常见肿瘤。女性癌症幸存者所接受的放化疗可导致卵泡池耗竭、血管损伤，使其发生绝经提前和原发性卵巢功能不足的风险增加[3]。其中卵泡耗竭是卵巢损伤的标志，对卵巢储备损伤最明显的是烷化剂治疗。绝经提前会降低生活质量，引发骨质疏松、心血管疾病以及抑郁等身体、心理疾病。即使癌症治疗后幸存者恢复了卵巢功能，仍可能面临生育期缩短等问题。另一方面，随着年龄的增加（尤其是35岁以后），卵巢储备以及卵子质量显著下降、卵子非整倍体比例明显上升，也是影响女性生育力的重要因素。因此，女性生育力保存技术目前已成为生殖医学领域研究的热点[4]。


胚胎冷冻、卵巢组织冷冻以及卵母细胞冷冻是目前可行的可用于保存女性生育力的辅助生殖技术[5]。其中胚胎冷冻技术存在一系列局限性，首先该技术要求患者有配偶，对无配偶的育龄妇女及儿童患者并不适用；再者该技术周期长，需要进行2～4周的促排卵治疗来获取卵子以体外受精，这将会延迟癌症的治疗，甚至还可能促进部分癌症的发展，对于癌症治疗紧迫、时间不能延迟的患者并不适用；除此之外，胚胎冷冻技术也不适合对激素敏感的患者。卵母细胞冷冻技术同样有其局限性。和胚胎冷冻技术类似，该技术也需要2～4周的时间进行促排卵治疗，在时间方面的不利影响同样存在，且该技术不能保存卵巢的内分泌功能；其次因为卵子的结构比较特殊，其冻存耐受性差，成功率比之胚胎冷冻技术较低。而卵巢组织冷冻技术指通过深低温冷冻技术的方法，把完整卵巢或部分卵巢组织冷冻储存以达到长期保留的目的，当女性生育力下降或丧失后，需要再生育时可将冻存组织移植回体内，帮助患者重新获得生育能力或内分泌功能，并孕育健康后代。与其他生育力保存技术相比，卵巢组织冷冻具有独特的优势，其不受年龄和婚姻状况的限制，无需使用促排卵药物治疗，也不会延误恶性肿瘤患者的治疗，有望做到女性生育力和生殖内分泌功能的同时保存[6-7]。目前，卵巢组织冷冻技术适用人群包括：育龄期或青少年恶性肿瘤患者，包括乳腺癌，血液系统恶性肿瘤（白血病、霍奇金淋巴瘤等）；儿童癌症患者，其中神经母细胞瘤、霍奇金淋巴瘤、骨肉瘤、肾母细胞瘤及非霍奇金淋巴瘤是最常见的儿童和青少年癌症；妇科肿瘤患者，如子宫内膜癌，宫颈癌患者等；需要进行骨髓移植的患者，自身免疫性疾病需应用性腺毒性药物治疗的患者等[8-10]。卵巢组织了冷冻技术是急需治疗的恶性肿瘤患者保存生育力的最佳选择，也是青春期前女孩保存生育力的唯一选择[11-12]。目前，人体卵巢组织库已在世界各大医学中心逐渐建立，据报道，国外通过人卵巢组织冷冻自体移植技术，使得上百例患者妊娠并成功分娩后代[7]。卵巢冷冻技术有多种分类方法，按组织大小分为卵巢皮质冷冻和全卵巢冷冻，按冷冻方法分为慢速冷冻和玻璃化冷冻，按移植部位分为原位移植（盆腔内）和异位移植（盆腔外，如皮下或腹壁）[13-14]。


卵巢组织移植后缺血缺氧损伤导致的卵泡大量丢失与原始卵泡激活障碍及生长发育受限是阻碍移植成功率提高的重大障碍。一方面，卵巢移植物中组织血流灌注的解剖学基础是新生血管的侵入性生长，组织血流充分灌注所需时间的长短对于卵泡存活情况及移植组织的有效寿命具有十分重要的影响。在冻融卵巢组织片移植后的48小时内，新生血管尚未建立，早期移植物缺乏血供，缺血-再灌注诱生的氧代谢产物使得卵泡大量丢失，包括大约60%～95%的卵泡与25%的始基卵泡，而氧代谢产物对生长卵泡的影响更显著，几乎使得生长卵泡全部丢失。卵泡的大量损耗可导致移植组织明显缩小，呈现大部分的纤维化，也可影响卵泡生长的动态变化、激素环境以及生育力恢复的潜能[15-17]。另一方面，在上述缺血-再灌注过程中，氧自由基产生增多可导致线粒体功能下降、细胞膜受损、脂质过氧化等一系列氧化应激反应。机体内存在可以中和氧自由基的抗氧化分子，如已有大鼠实验证明的维生素C和甘露醇。实验同样表明，褪黑激素、土霉素、维生素C可有效降低氧自由基引起的组织坏死情况。然而，外源性添加抗氧化剂等干预措施安全性尚不确定，需要进一步的体内及体外实验研究证实。


除上述挑战以外，卵巢组织冷冻技术尚存在其它不足。对于育龄期恶性肿瘤患者而言，卵巢组织冷冻与移植可能引入恶性肿瘤细胞。尽管育龄妇女好发的大多数类型的肿瘤不会向卵巢转移，但卵巢移植仍然存在着一定的潜在风险[6,18]。比如白血病会影响全身，从而对患者产生更大的威胁，乳腺癌患者卵巢移植也存在中等的风险[19-20]。尤其是对血液系统肿瘤和神经母细胞瘤等肿瘤患者而言，将卵巢组织移植回患者体内会有较高的风险重新带入癌细胞。基于这些患者的现实情况，在疾病缓解后移植卵巢组织并不合适，应从卵巢皮质中分离窦前卵泡用于移植，卵泡包裹在基底膜中，将其从间质中分离出来，去除毛细血管、白细胞及神经组织，移植完全分离的卵泡，这是一种更安全的方法。因此，对于这些患者（患有全身性肿瘤），不推荐进行卵巢组织移植，人工卵巢、支架移植单个卵泡及原始卵泡的体外成熟也许是今后的选择[21- 22]。


女性生育力保存技术很大程度上满足了肿瘤等疾病康复者的生育需求，提高了肿瘤等疾病康复者的生殖健康。在多种生育力保存措施中，生育力保存手术、胚胎冷冻、卵母细胞冷冻、药物治疗、卵巢组织冷冻和体外成熟培养的联合应用，以及体外激活技术和干细胞技术的不断发展和应用是未来的发展趋势，为女性生育力的保存提供了更加灵活、可行的方案[23-25]。近来，3D打印技术不断进步，美国已报道了应用3D打印技术构建人工卵巢的研究。研究人员找到一种能够与生物相容的材料—明胶，它既能在液体状态下被打印，又能逐渐形成固体结构，研究人员利用明胶在3D打印技术的支持下制作出了人工卵巢支架的原型。研究人员还观察了人工卵巢对几代小鼠的影响，确认人工卵巢没有对小鼠带来任何明显的副作用。


卵巢组织冷冻与移植技术拥有广阔的应用前景，将成为解决女性生育力保存及内分泌功能恢复的有效途径。将卵巢组织冷冻-移植技术与卵泡体外培养技术（In Vitro Growth，IVG）、卵母细胞体外成熟技术（In Vitro Maturation， IVM）、体外受精-胚胎移植技术（In Vitro Fertilization-Embryo Tansfer，IVF-ET）等辅助生殖技术的结合，将给卵巢组织的冷冻保存和使用带来新的突破[26-27]。但就发展现状来看，该技术影响因素众多，尚存在诸多亟待解决的问题，如卵泡体外培养和卵母细胞体外成熟过程中卵母细胞的发育潜能与成熟率仍然不理想等。由于目前对人卵泡发育的调控机制的了解十分有限，改进卵泡及卵母细胞体外培养体系并提高卵母细胞成熟效率较为困难。要寻找提高生育力保存成功率的方法，需要针对影响生育力的多个关键环节即卵母细胞、卵泡和卵巢组织，从外在微环境和内在调控两方面，在分子、细胞、组织等多个水平进行系统研究[28-30]。在未来卵巢组织移植技术的研究中，借助卵泡内外调控通路，改善卵泡外界微环以降低缺血缺氧损伤，同时激活卵泡自身生长发育潜能，是卵巢组织冷冻复苏-移植后重建卵巢功能的重要手段。随着社会的进步和现代医学科学技术的不断发展，人类卵巢组织的冷冻与移植技术的研究、发展与临床应用将会被进一步推动。这项技术的逐步推广将为需要保存生育力的女性患者的治疗带来新的突破。


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