摘要：目的  探讨试管IVF周期中顶体酶活性与受精率的关系。方法  选取2016年1月至12月于本院生殖中心行人类辅助生殖技术助孕夫妇中男性175例，根据顶体酶活性分为异常组和正常组，异常组又根据顶体酶数值大小分为A组、B组、C组、D组、E组，A组患者10例，顶体酶（20～25）μIU/106；B组患者21例，顶体酶（26～31）μIU/106；C组患者33例，顶体酶（32～37）μIU/106；D组患者37例，顶体酶（38～43）μIU/106；E组患者37例，顶体酶（44.0～48.2）μIU/106；正常组37例，顶体酶＞48.2 μIU/106，比较各组受精率的差异。结果：异常组受精率78.93%，正常组受精率83.51%，两者比较差异无统计学意义；A组受精率为72.2%，B组受精率为79.15%，C组受精率为81.3%，D组受精率为81.14%，E组受精率为80.88%，正常组受精率83.51%，A组与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余两两比较差异无统计学意义。结论：对于顶体酶低于25 μIU/106患者，IVF受精率明显降低，建议行ICSI助孕，从而提高受精率增加辅助生殖技术的成功率。


关键词：顶体酶活性；IVF；受精率


根据世界卫生组织（WHO）规定，夫妻双方婚后同居1年以上，有正常性生活并未采取任何避孕措施女方未受孕者称为不孕不育［1］。全球约有12%的夫妇正在遭受不孕不育的困扰，我国育龄期夫妇患不孕不育的人数已达到12.5%～15.0%，其中由男性原因引起配偶不育者称为男性不育，约占不孕不育因素的50%[2]。近年来，随着生活方式和节奏的不断改变，男性不育的发病率正在逐年上升。


传统评估男性生育能力是通过精液常规参数（密度、活力、形态）进行的，精液常规检查是一项简单而重要的评价指标。但精液常规参数的异常约占男性不育原因的70%，精子功能学的异常也是导致男性不育的重要因素，并且逐渐受到人们的重视。精子功能学的检测指标有很多，精子顶体酶活性就是其中重要的一种，精子顶体酶活性的异常被认为是受精失败的重要原因，但在人类辅助生殖技术（ART）中，顶体酶活性的异常是否会导致受精失败却有不同的看法。本研究采用改良的Kennedy法检测精子顶体酶活性，并对顶体酶异常的病人进行分组，观察顶体酶活性对IVF受精率产生的影响，旨在为实验室选择人工助孕手段提供实验依据。


1  资料与方法


1.1  临床资料  回顾性分析2016年1月至2016年12月在山西省儿童医院妇幼保健行IVF助孕治疗的175对不孕不育夫妇，根据顶体酶活性分为异常组和正常组。女性年龄22～44岁，平均30岁，男方23～47岁，平均32岁。为排除女方因素对受精率的影响，该175对夫妻女方均为输卵管因素导致的不孕；男方精液检查的数目、活力和形态均达到做IVF助孕治疗的患者。顶体酶异常组（＜48.2 μIU/106）病例138例，异常组又根据顶体酶数值大小分为A组、B组、C组、D组、E组，A组患者10例，顶体酶（20～25）μIU/106；B组患者21例，顶体酶（26～31）μIU/106；C组患者33例，顶体酶（32～37）μIU/106；D组患者37例，顶体酶（38～43）μIU/106；E组患者37例，顶体酶（44.0～48.2）μIU/106；正常组37例，顶体酶＞48.2 μIU/106。6组患者的不孕年限、男方精子指标等参数差异无统计学意义，具有可比性。


1.2  方法


1.2.1  精液标本收集及常规参数分析  所有研究对象禁欲时间为3～7天，在取精室精液通过手淫法采集，收集于一次性无菌取精杯内，置于37 ℃恒温水浴锅中孵育，待其液化完全后，严格按照WHO第五版人类精液的标准进行精液常规检测分析（对于液化不完全的标本，采用反复吹打的方法使其液化）。


1.2.2  精子顶体酶活性的测定  精子顶体酶活性检测选用深圳华康生物医学工程有限公司生产的试剂盒，精子顶体内存在精氨酸酰胺酶，其活性可反映顶体的全部活性。精氨酸酰胺酶以Na-苯甲酰-DL-精胺酸-p-硝酰基苯胺（BAPNA）为底物，分解产生有色产物—硝酰基苯胺，通过测定该产物量可推算出精氨酸酰胺酶的活性。正常顶体酶参考值范围：（48.2～218.7）μIU/106。6组间的不孕年限、年龄、男方精子指标等参数无差异。


1.2.3  常规IVF  女方控制性超促排卵采用标准长方案，用药天数和剂量无明显差异。待大多数卵泡发育至18～21 mm后，给予人绒毛膜促性腺激素HCG4000-10000U肌注，32～36 h后在阴道B超引导下穿刺取卵。精液处理采用密度梯度离心+上游法，受精后16～18 h观看胚胎原核情况。


1.3  统计学分析  采用SPSS17.0 软件进行统计学分析,计量资料以“1566970422(1).jpg”表示，两组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。。


2  结果 


2.1  异常组和正常组患者年龄和受精卵比较  正常组和异常组在年龄方面无论男女差异均无统计学意义；异常组的受精率虽低于正常组，但差异无统计学意义，见表1。


表1  异常组和正常组患者年龄和受精卵比较

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2.2  6组患者年龄和受精卵比较  6组患者在年龄方面的差异无统计学意义，顶体酶异常组（A、B、C、D、E组）的受精率均低于正常组，A组患者与正常组比较差异有统计学意义（P＜0.05），其余各组（B、C、D、E组）与正常组比较差异均无统计学意义，见表2。


表2  6组患者年龄和受精卵比较

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注：与正常组比较，aP＜0.05


3  讨论


在过去的几十年，评判男性生育力高低主要就是通过精子的数量、活力和形态这些常规参数进行的。在人类辅助生殖技术ART助孕方案的选择中，也是根据精子常规参数的异常选择体不同的助孕手段，精子常规参数正常或者稍微偏低的选择外受精胚胎移植技术（IVF-ET）助孕，精子常规参数严重异常选择卵胞浆内单精子注射技术（ICSI）助孕。近年来，随着对男性不育机制研究的不断深入，发现引起男性不育的原因比较复杂，单纯检测精液常规已不能满足临床需要，一些新的精子功能学临床指标能更有针对性的评价男性不育，精子顶体酶活性检查就是其中之一。有研究表明，精子顶体酶活性和精子-透明质酸结合率异常是不明原因性不育症的潜在病因[3]。


顶体是人类精子特有的一种结构，存在于精子头部，富含各种水解酶和多糖，顶体酶是其中最重要。顶体酶是一种丝氨酸蛋白水解酶，以无活性的酶原存在于顶体的内膜和赤道部膜上，在酸性环境中，人精子顶体内透明质酸酶（HYD）是一种PH-20，具有HYD活性的糖基磷脂酰肌醇（GIP）的单链膜蛋白[4]。当精子头部进入卵细胞透明带时，存在于顶体内的顶体酶原才被活化成顶体酶，其能水解卵细胞透明带，从而精子才能进入卵细胞内与卵子融合，其活性低下会影响对卵细胞卵丘的分解及对透明带的穿透[5]。本研究采用的是改良Kennedy法检测人精子顶体酶活性，此法具有实用性强，样本不需特殊处理，试验时间短等优点，能很好的反映精子的穿透力，是近年常用检测顶体酶活性的的方法。


本研究结果显示，顶体酶活性小于48.2μIU/106的异常组受精率低于顶体酶正常组，差异无统计学意义；进一步对顶体酶异常组以5 μIU/106组间间距进行分组，各组与正常组受精率比较，各组受精率均低于正常组，但只有当顶体酶低于25 μIU/106时，与正常组比较其IVF受精率明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。这与国内的研究报告基本一致。孙琴等［6］研究结果显示，不明原因不孕夫妇男方精子顶体酶活性小于36 μIU/106时，受精率明显低于顶体酶活性大于36μIU/106精子组，对于此类顶体酶活性低下的不明原因不孕夫妇，极有可能存在精卵结合障碍。李冬梅等［7］研究发现，当精子顶体酶活力低于30μIU/106时，行常规IVF的受精率受精率大大降低，可考虑采取ICSI助孕技术提高受精率。但温子娜等［8］人研究发现，顶体酶活性正常组和异常组在ART治疗方案选择中的差异无统计学意义，精子顶体酶活性检测对辅助生殖技术治疗方案选择的临床指导意义不明确。出现以上不同结果的原因可能是：①与IVF周期中精液优化处理有关，离心+上游法在处理精液过程中，活力和形态差的精子被清除，精子得到优化；②未对顶体酶异常组进行进一步的细化分组比较差异，只是单纯的分为了顶体酶异常组和正常组，本实验中单纯异常组和正常组比较，虽然受精率降低，但差别无统计学意义；③与每个中心采有的实验试剂、实验仪器及操作人员的不同有关。


综上所述，尽管男性不育相关因素比较多，但精子顶体酶活性是评价精子功能的一项重要的客观定量指标，对评价男性的生育能力有重要作用。在研究中当顶体酶活性小于25 μIU/106时，其IVF受精率明显降低，采用ICSI助孕治疗以提高受精率。本次研究可为以后临床和实验室筛选IVF或者ICSI助孕方案提供实验依据，有助于提高男性不育的诊治水平。


参考文献

[1] Fode M, Fusco F, Lipshultz L, et al. Sexually transmitted disease and male infertility: A systematic review[J]. Eur Urol Focu, 2016,2(4):383-393．

[2] Abdi F, Roozbeh N, Mortazavian AM. Effects of date palm pollen on fertility: Research proposal for a systematic review[J].. BMC Res Notes, 2017,10(1):363．

[3] 马征兵,薛力.精子的顶体酶活性与受精能力的临床研究[J].中国性科学,2019,28(7):33-36

[4] Martin-Deleon P A, Germ-cell hyaluronidases:their role in sperm function[J]. Int J Androl, 2011,34(5):2.

[5] Yu JJ, Xu YM. Ultrastructural defects of acrosome in infertile men[J]. Arch Androl, 2004,50(6):405-409.

[6] 孙琴,李鸿儒,梁元姣,等.精子顶体酶检测对不明原因不孕夫妇助孕治疗方案选择的临床意义[J].中华男科学杂志,2017,23(2):152-156.

[7] 李冬梅,李素云,黎平.精子顶体酶活性与受精方式的选择[J].华北煤炭医学院学报,2011,13(1):1-2

[8] 温子娜,卢奋坚,段礼,等.精子顶体酶活性与受精方式的选择[J].中国性科学,2018,27(5):24-26