曹云霞 校长

 

　　线粒体是细胞中为细胞提供生命活动所需能量的细胞器。线粒体内存在少量DNA，称为线粒体DNA（mtDNA）。而涉及氧化磷酸化过程的各种酶类需要核DNA和mtDNA的共同参与。mtDNA编码37个基因，绝大多数细胞中都存在大量线粒体，尤其是卵母细胞[1]。mtDNA可以通过母亲卵母细胞内的线粒体遗传给子代。mtDNA突变会导致子代发生一系列罕见但是严重的疾病。卵母细胞中mtDNA发生突变引起的母系家族性疾病，称为遗传性线粒体疾病。线粒体疾病的临床表现多变且与mtDNA突变的程度和数量有关，突变型mtDNA的数量越多即相对而言野生型mtDNA数量越少则疾病症状越严重[2]。其典型的临床特征是通常影响能量需求较高的组织和器官，如中枢神经系统、骨骼肌、心脏，表现为线粒体脑病、线粒体肌病、线粒体脑肌病、视觉/听觉功能障碍、呼吸系统疾病等。自从1988年发现第一例mtDNA突变导致的疾病以来，已经发现超过700中mtDNA突变，包括生殖细胞和体细胞突变[1]。然而，绝大多数线粒体疾病到没有可靠的产前诊断方法和有效的治疗方法，目前有限的治疗仅仅是早期发现和缓解某些可控制的症状，如癫痫、心脏病、糖尿病、乳酸中毒等[3]。


　　mtDNA是通过卵母细胞遗传至子代，即呈现出母源性遗传方式。而基于卵子/胚胎显微操作技术的线粒体置换(mitochondria replacement, MR) 可减少异常mtDNA从母亲传递给子代，从而避免线粒体疾病的子代出生，为遗传性线粒体疾病的治疗开辟了新的天地。到目前为止，线粒体置换方式主要包括原核移植、纺锤体–染色体复合物移植和极体移植[1]。


　　原核移植(pronucleus transfer，PNT)
　　哺乳动物受精卵阶段的典型特征是两种原核的存在，每个均清晰可见且包含来源于精子或卵子的单倍体核DNA。在80年代早期，科学家们已经在小鼠中实现了将双原核从一个受精卵转移到另一个受精卵，证实了小鼠重构受精卵可以发育并生育子代[4]。然而，由于在原核移植过程中不可避免会将原核周围少量细胞质中的线粒体一起转移到新的细胞中，导致子代细胞质中存在mtDNA混杂的现象[5]。最新研究显示，在7个幼鼠的活检组织中检测出平均24%的异质性水平，在子二代中同样检测出类似的异质性水平相关[5,6]。研究提示了原核移植可能会导致不可预测数量的线粒体共转移。


　　纺锤体–染色体复合物移植(spinlde-chromosome transfer, ST)
　　2009年，美国科学家首次在猕猴上开展纺锤体–染色体复合物移植预防线粒体遗传病的研究，结果发现在未受精的卵母细胞阶段可以完成线粒体捐赠技术。其安全性和有效性也由之后的生育子代、子代正常的生长曲线和携带低水平mtDNA被证实[7,8]。随后，研究继续将纺锤体–染色体复合物移植在捐赠的人卵母细胞中进行，然而纺锤体–染色体复合物移植后的重构卵异常受精率却显著升高。在所获得的胚胎肝脏细胞中检测出mtDNA的异质性<1%[9]。然而，由于mtdna存在随机的遗传漂变和分离现象，纺锤体–染色体复合物移植的子代的某些组织和器官可能会存在更高的异质性。更令人担心的是由于“遗传瓶颈”现象的存在，由纺锤体–染色体复合物移植产生的混杂mtdna的女性个体，其子代的线粒体疾病再发的可能性[10]。< span="">


　　极体移植（polar body transfer，PBT）
　　卵母细胞形成过程中会经历两次减数分裂过程。第一次减数分裂产生一个第一极体（polar body 1，PB1），包含一个二倍体染色体组。第二次减数分裂产生一个第二极体（polar body 2，PB2），包含一个单倍体染色体组。2014年6月，本课题组首次提出极体移植作为线粒体置换技术可阻断线粒体遗传病的传递，极体移植包括第一极体移植和第二极体移植[5]。其中，第一极体移植是指从未受精的卵子中取出第一极体并将其移植到去除核DNA的未受精的供卵中。第二极体移植是指从受精卵中取出第二极体并将其移植到去除雌原核的受精卵中去。目前的研究充分显示了小鼠的第一极体和第二极体有一个完整的基因组；第一极体可以取代成熟的卵母细胞的纺锤体，而第二极体可以取代合子的雌原核[5]。使用卵子的第一极体置换卵子中期纺锤体–染色体复合物，以及使用受精卵的第二极体置换受精卵的雌原核均成功获得了重构胚，移植入小鼠体内获得妊娠，小鼠出生率与各种操作后和未经操作的对照组类似，并成功获得健康的子一代和子二代[5]。与原核移植和纺锤体–染色体复合物移植相比，极体移植具有明显的优势,主要包括：第一极体和第二极体所携带的线粒体明显更少于纺锤体和原核，极体移植的小鼠体内核供体来源的线粒体明显少于纺锤体和原核移植，因此极体移植降低了线粒体DNA残留的风险；与纺锤体移植相比，极体移植降低了染色体残留的风险；从技术上讲，第一极体与第二极体移植比原核移植和纺锤体–染色体复合物移植更加安全，后者需要使用细胞骨架抑制剂处理患者的卵母细胞或合子，并用显微操作针吸取细胞核，核DNA包含一部分细胞膜和少量的细胞质。极体是自然形成的细胞核，可以用显微操作针简单地去除并融合或注射到卵母细胞或受精卵中。极体活检已是许多提供PGD和PGS中心的一个常规技术；增加同时行第一极体和纺锤体–染色体复合物移植，或者第二极体和原核移植的可能性，使每个患者的周期成功率翻倍。


　　英国人类受精与胚胎管理局(human fertilisation and embryology authority, HFEA)和美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration, FDA)对线粒体置换技术的评估总结认为目前仍需要对某些问题进行研究以确认线粒体置换相关技术的安全性和有效性，尤其是子代中mtDNA混杂现象这一问题。子代细胞中混杂的突变型mtDNA是否会不断复制扩增，待达到一定水平后再导致子代发病？供体和受体mtDNA会否相互作用导致某种效应？由于目前极体移植尚停留在动物研究阶段，要证实极体移植是安全的、有效的，仍然需要使用人类卵母细胞进行研究，以探索极体移植后的重构胚胎能否正常发育，且是否从极体中携带很少的残留mtDNA。在此基础上进一步探索核-线粒体相互作用以及长期持续的表观遗传修饰，探索预防过早激活卵母细胞或检测异常受精的卵母细胞的方法，以期建立安全高效的线粒体捐赠技术平台，实现彻底阻断母源性线粒体遗传病。


参考文献：

1. Wolf DP, Mitalipov N, Mitalipov S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 2015,21(2):68-76.
2. Taylor RW, Turnbull DM. Mitochondrial DNA mutations in human disease. Nat Rev Genet. 2005,6(5):389-402.
3. Craven L, Elson JL, Irving L, Tuppen HA, Lister LM, Greggains GD, Byerley S, Murdoch AP, Herbert M, Turnbull D. Mitochondrial DNA  disease: new  options for  prevention. Hum Mol Genet. 2011,20(R2):R168-174.
4. McGrath J, Solter D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery and cell fusion. Science. 1983,220(4603):1300–1302.
5. Wang T, Sha H, Ji D, Zhang HL, Chen D, Cao Y, Zhu J. Polar body genome transfer for preventing the transmission of inherited mitochondrial diseases. Cell. 2014,157(7):1591–1604.
6. Sathananthan AH, Trounson AO. Mitochondrial morphology during preimplantational human embryogenesis. Hum Reprod. 2000,15 Suppl 2:148-159.
7. Tachibana M, Sparman M, Sritanaudomchai H, Ma H, Clepper L, Woodward J, Li Y, Ramsey C, Kolotushkina O, Mitalipov S. Mitochondrial gene replacement in primate offspring and embryonic stem cells. Nature. 2009,461(7262):367-372. 
8. Lee HS, Ma H, Juanes RC, Tachibana M, Sparman M, Woodward J, Ramsey C, Xu J, Kang EJ, Amato P, Mair G, Steinborn R, Mitalipov S. Rapid mitochondrial DNA segregation in primate preimplantation embryos precedes somatic and germline bottleneck. Cell Rep. 2012,1(5):506-515.
9. Paull D, Emmanuele V, Weiss KA, Treff N, Stewart L, Hua H, Zimmer M, Kahler DJ, Goland RS, Noggle SA, Prosser R, Hirano M, Sauer MV, Egli D. Nuclear genome transfer in human oocytes eliminates mitochondrial DNA variants. Nature. 2013,493(7434):632-637.
10. Tachibana M, Sparman M, Sritanaudomchai H, Ma H, Clepper L, Woodward J, Li Y, Ramsey C, Kolotushkina O, Mitalipov S. Mitochondrial Gene Replacement in Primate Offspring and Embryonic Stem Cells. Nature. 2009,461(7262):367-372.