乳杆菌属维持正常阴道酸性环境，卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌和惰性乳杆菌是中国健康女性最常见优势菌种[1]。如果优势乳杆菌减少，其他多种微生物（主要为厌氧菌）增多，将导致的无阴道黏膜炎症表现的临床综合征——细菌性阴道病，它与宫颈炎、盆腔炎、不孕症、异位妊娠、性传播感染等发生相关，妊娠期可增加自然流产、早产、胎膜早破、绒毛膜羊膜炎、新生儿感染等并发症，严重影响了女性生殖健康[2]。加德纳菌是阴道菌群的重要组成部分，并且一直被认为是细菌性阴道病的一个重要的致病菌。外阴阴道假丝酵母菌病是由假丝酵母菌感染引起的外阴阴道炎症，是最常见的妇女外阴阴道炎症之一，致病菌主要是白色假丝酵母菌。中药制剂妇肤康喷雾剂是妇产科常用外用药物之一，在临床上主要用于各种阴道疾病的治疗。然而该药在阴道使用后，是否会对阴道微环境中的益生菌或致病菌的生长及增殖产生影响尚未见报道，本课题将体外了解妇肤康喷雾剂对阴道常见的两种益生乳杆菌和常见的两种致病菌的影响和杀灭作用，为临床阴道感染用药提供药物应用的理论依据，指导临床用药。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1菌种来源  为了真实的反应该药物对阴道中乳杆菌生长的影响，本实验中所用阴道乳杆菌菌株均是从中国健康妇女阴道分泌物中分离纯化所得，革兰染色后经油镜镜检证实为革兰阳性大杆菌，并且进行16rRNA 测序鉴定为1#卷曲乳杆菌、2#詹氏乳杆菌。致病菌：加德纳菌（ATCC：14018）和白色念珠菌（ATCC 90029）。

1.1.2药物来源 

妇肤康喷雾剂（100毫升/瓶，贵州良济药业有限公司，国药准字Z20026246）

基金项目：总基金名称国家自然科学基金：中国健康女性阴道乳杆菌菌种多样性研究（81170535）；国家自然科学基金：细菌性阴道病复发与阴道菌群的研究（81200411）

作者简介：王奔（1985-），男，医师，从事妇产科微生态与感染性疾病研究，Email：wb111222@sina.com

通讯作者：廖秦平，Email：qinping_liao@163.com

1.1.3培养基  本实验中，乳杆菌培养使用BD公司的MRS培养基（MRS Broth和MRS Agar），白色念珠菌：固体培养使用沙氏葡萄糖培养基、液体培养使用营养肉汤培养基，加德纳菌：固体培养使用Medium 70: Casman's medium base with 5% rabbit blood、液体培养基使Medium 1685: NYC III medium。
1.2 方法

1.2.1细菌的分离纯化  按照张瑞等的方法完成[3]。

1.2.2制备菌悬液  分别将分离得到的1#，2#乳杆菌分别吸取100 μL菌液接种于MRS液体试管中，将ATCC加德纳菌种吸取100 μL菌液接种于Medium 1685中，白色念珠菌种吸取100 μL菌液接种于营养肉汤培养基中，37 ℃静置培养24 h待用。

1.2.3制备实验组和对照组的生长曲线  实验组按5%的接种量分别接种到50 mL妇肤康溶液作为培养基三角瓶中。对照组中使用相应的液体培养基。在0、3、6、9、12、15、18、24、30和36 h分别取上述37 ℃静置培养的实验组和对照组培养液100 μL并用无菌水分别稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5和10-6，用滴注法分别取10-3、10-4、10-5和10-6四个稀释梯度点滴到MRS固体平板（乳杆菌），取10-1、10-2、10-3和10-4四个稀释梯度点滴到沙氏葡萄糖固体平板（白色念珠菌），取10-1、10-2、10-3和10-4四个稀释梯度点滴到Medium 70（加德纳菌），每次滴加100 μL，每个稀释度做2个平行对照，48 h后计数菌落数。

1.3 结果判定  计算细菌浓度（CFU/mL）=平均菌落数目×稀释倍数×10。生长曲线的制作：取细菌浓度的对数值（lgCFU）与时间点的对应关系，更加直观的了解细菌数量级的变化情况

2 结果

2.1 实验使用细菌培养  共收集健康女性阴道分泌物3份，全部经革兰染色判定。从3份标本中，分离出2株乳杆菌，经过菌落PCR鉴定。

2.2 妇肤康喷雾剂对阴道乳杆菌生长曲线比较  结果见图1、图2：妇肤康组的生长曲线随着时间延长有一个数量级的下降（10倍），乳杆菌轻微下降。对照组正常生长，曲线上升了2个数量级（100倍）。

 

                 图1  2#菌生长曲线（妇肤康组vs对照组）

图2    1#菌生长曲线（妇肤康组vs对照组）

 

2.3 妇肤康喷雾剂对白色念珠菌生长曲线比较  结果见图3：妇肤康组生长曲线随时间延长有一个数量级的下降（10倍）。而对照组生长曲线随着时间延长上升了4个数量级（10 000倍）。

 

图3  白色念珠菌生长曲线（妇肤康组vs对照组）

2.4 妇肤康喷雾剂对加德纳菌生长曲线比较  结果见图4：妇肤康组的生长曲线向下到15 h加德纳菌被完全杀灭。而对照组生长曲线上升了3个数量级（1 000倍）。

 

图4  加德纳菌生长曲线（妇肤康组vs对照组）

 

3 讨论

女性阴道是一个复杂的微生态体系，由阴道的解剖结构、微生态菌群、局部免疫及机体的内分泌调节功能共同组成。多种微生物共同寄生在健康妇女阴道微环境中，包括：乳杆菌、大肠埃希菌、链球菌、棒状杆菌、韦荣球菌、加德纳菌和除了细菌以外的病毒、原虫、白假丝酵母菌、支原体等。乳杆菌分解阴道上皮细胞的糖原产生乳酸，降低pH，拮抗致病微生物。还可以产生过氧化氢而杀菌，乳杆菌还能产生细菌素或者占位效应等多种功能共同维持健康阴道微环境。乳杆菌是公认的阴道内最常见的优势菌种。最新调查发现健康人群中，正常菌群可以分为5大类，其中I型为卷曲乳杆菌为主，V型为詹氏乳杆菌为主[4]。中国健康女性调查也发现，最常见的两种乳酸杆为卷曲和詹氏乳杆菌[1]。

细菌性阴道病（BV）是育龄期妇女最常见的阴道感染，症状特点是：阴道乳杆菌被厌氧菌取代，如加德纳菌、普氏菌、消化道链球菌、类杆菌等。Gardner和Dukes第一次将加德纳菌和BV联系起来，其报道能从92%的BV患者体内分离出加德纳菌，而健康女性未分离出来。加德纳菌曾经被认为是BV的主要致病菌。随着研究的深入，人们认为加德纳菌不再是主要因素，而是因为阴道正常的细菌数量增长了100～1000倍。但是现在分子生物学的进展发现，加德纳菌使微环境改变而适合严格厌氧菌的生长，同时可形成生物膜而产生耐药[2]，于是其在细菌性阴道病的发病过程中的作用又开始重新被认识。白色假丝酵母菌是最常见致病菌之一，虽然随着抗真菌药物的广泛应用，非白色假丝酵母菌造成的疾病比例在逐渐上升。但是国内刘朝晖等调查发现白色假丝酵母菌仍是造成霉菌性阴道炎（VVC）的最常见的致病菌，占88.4%，而其他一些非白色假丝酵母菌依次为光滑假丝酵母菌（5.2%）、伪热带假丝酵母菌（1.6%）、星型假丝酵母菌（1.2%）、近平滑假丝酵母菌（1.2%）、平滑假丝酵母菌（0.8%）及季也蒙假丝酵母菌（0.8%）等。本次实验选择的研究菌种是健康人和疾病人群中最常见的益生菌和致病菌。

妇肤康喷雾剂主要是以千里光，爵床经现代制药工艺做成的复方制剂。千里光属植物为多年生草本，我国资源丰富，各地民间广泛用于治疗各种炎症和皮肤病，疗效显著。据文献报道：千里光有明显的广谱抗菌作用，对炎症有较好的疗效。化学成分研究表明含酚酸类及生物碱。药理实验表明酚酸类化合物为千里光的抑菌有效部分。抑菌实验结果，醌类和对羟基苯乙酸对流感杆菌、肝炎球菌、甲链球菌、卡他球菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌等均有抑菌作用[5]。爵床有抗肿瘤抗病毒的作用，并能治疗女性急性尿路感染[6]。中药制剂妇肤康喷雾剂已经在临床广泛用于阴道炎的治疗，因此明确该药物对常见阴道益生菌和致病菌的增殖影响有重要意义。本研究结果表明：妇肤康溶液在体外情况下对阴道乳杆菌的增殖有轻微的影响，但是大部分乳杆菌能够存活下来。白色念珠菌在妇肤康溶液中曲线有下降，本实验对妇肤康溶液中的念珠菌进行革兰涂片镜检，发现其没有菌丝，只含有孢子。这说明其对念珠菌能起到明显的抑菌功能，可以在VVC疾病治疗中发挥作用。加德纳菌在妇肤康溶液中15 h后可完全杀灭，提示对细菌性阴道病的治疗可能是通过杀灭加德纳菌等致病菌而发挥功效。由于体内药物效果与体外实验之间存在着一定的差别，因此该药物在人体内使用时，上述作用的发挥可通过进一步的研究来加以证实。

 

参考文献

[1] Zhang R，Daroczy K，Xiao B， et al．Qualitative and semiquantitative analysis of Lactobacillus species in the vaginas of healthy fertile and postmenopausal Chinese women[J]．J Med Microbiol，2012，61（Pt 5）：729-739．

[2] Turovskiy Y，Sutyak NK，Chikindas ML．The aetiology of bacterial vaginosis[J]．J Appl Microbiol，2011，110（5）：1105-1128．

[3] ZHANG Rui，CHEN Rui，SANG Jia-te，et al．Effect of compound Hippophae Rhamnoides seed oil suppository on proliferation of vaginal Lactobacillus in vitro[J]．Chin J Microecol，2013，25（4）：390-392．（in Chinese）

张瑞，陈锐，桑佳特，等．复方沙棘籽油栓对阴道乳杆菌增殖影响的体外研究[J]．中国微生态学杂志，2013，25（4）:390-392．

[4] Ravel J，Gajer P，Abdo Z，et al．Vaginal microbiome of reproductive-age women[J]．Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（Suppl 1）：4680-4687．

[5]WU Bing，WU li-jun. Advances in Studies on Chemical Constituents of Senecio[J]. CHINA JOURNAL OF CHINESE MATERIA MEDICA，2003，28（2）：97-100．（in Chinese）

吴斌，吴立军．千里光属植物的化学成分研究进展[J]．中国中药杂志，2003，28（2）：97-100．

[6]LIU guo-rui,WU JUN,YANG mei-hua.Study advances of Medicinal Plant Justicia procumbens L[J].NORTHWEST PHARMACEUTICAL JOURNAL, 2008，23（1）：55-56．（in Chinese）

刘国瑞，吴军，杨美华，等．药用植物爵床的研究进展[J]．西北药学杂志，2008，23（1）：55-56．

                                   收稿日期：2013-12-23                      修回日期：2014-01-