【摘 要】 纺锤体检查点是在细胞有丝分裂期保证染色体正确分离的重要监控机制，维持着基因组稳定性。纺锤体检查点的分子调控机制已逐步明确，许多肿瘤细胞存在纺锤体检查点功能缺陷，纺锤体检查点表达量的失调、基因单核苷酸多态性及启动子甲基化等可能与其功能异常有关。抗肿瘤药物通过影响纺锤体检查点的表达而启动杀伤肿瘤效应。深入了解肿瘤纺锤体检查点调控机制，有助于发现新的杀灭肿瘤细胞的靶向化疗药物。

　　【关键词】纺锤体检查点；肿瘤；有丝分裂；染色体分离；细胞周期

　　细胞周期监控机制——检查点，是时空调节细胞生命活动的物质基础，是维持细胞基因组完整性的重要手段。细胞周期检查点主要包括：DNA损伤检查点（DNA damage checkpoint）、DNA复制检查点（DNA replication checkpoint）和纺锤体检查点（spindle checkpoint）等细胞周期检查点。其中纺锤体检查点，又称有丝分裂检查点（mitotic checkpoint）【1】 ，是细胞周期的最后监控机制，目前对其分子组成和调控机制的研究正逐步开展，是肿瘤领域研究的热点。

　　纺锤体检查点的定位及组成

　　着丝点（kinetochore）又称为动点、动粒。是附着于着丝粒（centromere）上的一种细胞器。而着丝粒则是指染色体主缢痕部位的染色质。着丝点的外侧主要用于纺锤体微管附着，内侧与着丝粒相互交织。每条中期染色体上含有两个着丝点。分别位于着丝粒的两侧。细胞分裂后，两个着丝点分别被分配到两个子细胞中。电镜下，着丝点为一个圆盘状结构，分为4个功能区域：内层（inner plate）、中间带（interzone）、外层（outer plate）和纤维冠（fibrous corona）。外层着丝点是直接和微管相结合的部位，其不仅需要介导着丝点-微管（KT.microtubule）的连接，也发挥纺锤体组装检查点的功能，监测是否形成了正确的着丝点-微管连接。其中纺锤体检查点蛋白即定位于外层着丝点并执行监控功能【1】 。

　　早期研究发现，向具有某些基因突变的芽殖酵母中加入破坏微管的药物，此类药物阻滞酵母有丝分裂的能力受阻，筛选的这些突变基因为：Mad1,Mad2,Mad3和Bub1,Bub2,Bub3,提示这些基因产物是执行纺锤体检查点功能必需的。后来又发现，纺锤体极复制基因Mpsl（或Ttk）也是纺锤体检查点的组成成分。除Mad3外，其他基因在进化上高度保守。哺乳动物纺锤体检查点有一蛋白，与酵母MAD3蛋白氨基端序列和羧基端丝/苏氨酸蛋白激酶功能区高度同源，称为BUBR1（BUB1 related,BUBR1或BUB1B）。这些基因在所有的真核生物中都是保守的，共同参与了有丝分裂前期激活信号转导通路。主要是防止姊妹染色单体过早分离，统称为纺锤体检查点【2】 。

　　纺锤体检查点的信号途径

　　有丝分裂进行到中期，染色体成功排列在赤道板上，此时，纺锤体呈现较为成熟的双极纺锤体，部分纺锤体微管被着丝点捕获形成着丝点一微管并介导染色体向赤道板排列，同时，未与着丝点连接的星状体微管（astral microtubule,除着丝点一微管外的纺锤体微管）呈放射状分布，并通过其末端蛋白与细胞皮层连接以调控和维持细胞的形态变化。此时着丝点-微管之间的黏附及着丝点之间的张力变化决定着纺锤体检查点激活与失活状态【3】 。

{NextPage}　　BUB1作为纺锤体检查点上游成分，是一种蛋白丝氨酸-苏氨酸激酶。细胞进入有丝分裂后，当发现着丝点没有相应的微管附着时，即可定位于着丝粒并自身高度磷酸化而活化。蛋白激酶BUB1优先定位于着丝点，可能是其他成分定位着丝点的基础。目前研究认为。纺锤体检查点在有丝分裂过程中的信号传导途径如下：在细胞分裂的前中期，没有与纺锤体发生连接的动粒会产生一个等待信号，BUB1定位于着丝点并活化。招募MAD1和MAD2于着丝点上，MAD1激发MAD2构象变化，由钝性构象向活性构象转化，有助于结合CDC20,从而形成BUBR1-BUB3-MAD2-CDC20有丝分裂检查点复合体来抑制CDC20以免激活泛素化连接酶后期促进复合物（anaphase-promoting complex/cyclosome,APC/C），抑制其泛素化作用。从而避免下游因子SECURIN的降解、后续因子SEPARASE活化及C0HESION的被切割，防止姊妹染色体过早分离。当所有染色体与微管结合并产生双极定向就会抑制纺锤体检查点信号，CDC20从APC/C上释放使之激活，从而使SECURIN泛素化被蛋白酶体降解，继而活化SEPARASE,将COHESION切割，从而姊妹染色体分离，细胞进入有丝分裂后期，完成有丝分裂【4-5】 。

　　以上为纺锤体检查点参与有丝分裂过程中的主线，而这一过程中。纺锤体检查点的互相调控并与其他信号通路形成“串联”或“并联”,组成一个时空调控网络。

　　纺锤体检查点在组织细胞中的分布

　　着丝点的经典模式显示纺锤体检查点蛋白定位于着丝点上，是执行纺锤体检查点功能的关键组分。但BUB2例外，位于纺锤体极上，主要监测纺锤体位置，调控细胞退出有丝分裂和细胞质分裂。进一步研究发现，纺锤体检查点分布具有组织特异性，而在细胞中亦不仅局限于细胞核。

　　Burum-Auense等【6】通过免疫组化检测睾丸生殖细胞肿瘤中纺锤体检查点蛋白的表达。发现5%的初级精母细胞核内有AURKA染色。一些细胞质中伴有弱的着色。在36%的精母细胞核中MAD2阳性，一些细胞质中伴弱阳性。而68%的初级精母细胞和一些精原细胞的细胞质中，BUB1B着色强阳性，但精原细胞要弱于初级精母细胞。此研究从形态学上说明纺锤体检查点蛋白的作用可能不止限于细胞核内。而延及其他亚细胞器。

　　纺锤体检查点与肿瘤发生

　　染色体不稳定性是许多肿瘤的标志，而有丝分裂调节因子的改变在染色体不稳定性的肿瘤中较常见。目前一项有关肿瘤染色体不稳定性特征的基因表达谱研究发现。在70个与染色体不稳定高度相关基因中，有29个为有丝分裂调节因子。许多涉及到中心体周期或为纺锤体检查点因子（AURKB,MAD2L1,F1TG1,ZWINT 和CDC20）【7】 。Yao等【8】通过定制基因芯片分析35例子宫内膜癌组织基因表达谱，发现BUB1.NDC80和AURKA等高表达与肿瘤高级别分化有关。这两项研究从基因表达谱的层面展示了纺锤体检查点基因在肿瘤中的表达，研究者试图进一步从表达量上探索纺锤体检查点对机体细胞的影响。Jeganathan等【9】通过动物模型体内实验发现，Bubl完全敲除小鼠胚胎期即是致死性的，Bubl减效基因小鼠（hypomorphic mice）尽管伴有减弱的有丝分裂检查点活性和高异倍体率，但是生存、繁殖能力大体正常。相对于Bubl减效基因小鼠，拥有轻微的BUB1蛋白减少的Bubl单倍剂量不足小鼠（haploinsufficient mice），在较低的程度上亦表现出检查点活性降低和异倍体率增加。Bubl减效基因小鼠具有较高的肿瘤自发性，而Bubl单倍剂量不足小鼠则无此现象。{NextPage}此研究表明，Bubl减少至一临界值可能引发肿瘤发生。

　　目前大多研究表明，在肿瘤细胞中纺锤体检查点基因突变较少见，多表现为表达水平的改变。如BUB1的少量突变见于结直肠癌、肺癌、甲状腺癌和T淋巴细胞白血病等，而在人类肿瘤如结直肠癌、急性髓系白血病和食管癌等则常见BUB1表达量减少，而在前列腺癌、乳腺癌和非子宫内膜样子宫内膜癌中BUBl则为高表达【10】 。

　　某些情况下。一些特殊的有丝分裂调节因子上升和下降都可引起染色体不稳定性。Hemando等【11】发现，结肠癌HCT116细胞系MAD2高表达后伴有较高的异倍体率。而通过RNA干扰（RNAi）MAD2表达后亦出现较高异倍体率。这提示一些特殊的肿瘤细胞，MAD2的上调或下调都可诱发纺锤体检查点功能缺陷和染色体失衡。同一纺锤体检查点分子的上调或下调可引起相似的基因变化。

　　纺锤体检查点基因的其他异常亦可能参与肿瘤的发生。Lo等【12】检测698例原发性乳腺癌患者和1492例健康对照者有丝分裂有关基因TTK（MPS1),MAD2L1,BUB1,BUB1B和PTTG1（SECURIN）单核苷酸多态性，发现TTK和PTTG1的两个单核苷酸多态性（TTK为G21650C,PTTG1为C1892G）在患者与健康者间差异有统计学意义，与乳腺癌风险相关；单倍体和单倍体联合分析表明，TTK，BUB1B和FI-TG1与乳腺癌风险有强烈的相关性,雌激素暴露增加了上述风险。该项研究表明，有丝分裂有关蛋白除了经典的基因突变、表达量的变化外，单核苷酸多态性等机制亦可能参与肿瘤发生。Park等【13】研究则发现，宫颈腺癌细胞系Hela和肺癌细胞系LL86，HCC95,HCC1171，HCC2108和NCIH596中BUBR1低表达与BUBR1启动子在R1（-346）和R2（-342）的胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸（CpG）位点高度甲基化有关，而细胞系L132,SK-LU-1和SK-MES-1中BUBR1高表达则与启动子低甲基化有关。同样肝细胞癌中存在MAD2的转录缺陷，而这种MAD2降调与MAD2启动子超甲基化导致转录沉默有关。

　　纺锤体检查点与肿瘤治疗

　　监控着丝粒-微管间黏附的纺锤体检查点涉及到肿瘤的发生。可是纺锤体检查点与细胞死亡间的关系尚不清晰。正常情况下，纺锤体检查点推延细胞分裂后期和有丝分裂的退出，直至所有的着丝粒都稳固地黏附于微管（MTs）上，通过此机制使非整倍体发生率最小化。当细胞经过化疗药物的作用。在有丝分裂期不能通过纺锤体检查点关卡检验时，则会出现几种结局：①一些细胞在有丝分裂时通过有丝分裂灾变死亡。②一些退出有丝分裂后在G1期通过凋亡途径而死亡。③一些退出有丝分裂产生四倍体，在此后的增殖中死亡。微管抑制剂通过激活纺锤体检查点而影响有丝分裂，最终引起细胞毒性。肿瘤治疗中涉及细胞死亡途径不仅包括凋亡。而且还有坏死、自噬、有丝分裂灾变和衰老【14】 。

　　早在提出“纺锤体检查点”概念前。微管抑制剂抗癌药如紫杉醇和长春碱类就已应用于临床。其主要作用靶点是微管。研究表明，这些药物亦作用于细胞周期的纺锤体检查点。抗有丝分裂剂通过激活纺锤体检查点，干扰纺锤体聚集，导致有丝分裂阻滞，诱发凋亡。癌细胞可由于“功能减弱”的检查点或快速滑脱，在细胞启动凋亡前提前退出有丝分裂，而表现对此种杀伤的抵抗性。阻止有丝分裂退出的下游检查点可能抵消此种抗性。Huang等【15】应用单细胞技术，通过敲除CDC20阻止有丝分裂退出，可减缓CYCLINB1水解，由此允许更多时间启动死亡程序。

{NextPage}　　针对化疗药物、纺锤体检查点与细胞死亡间的关系，Niikura等 进一步研究，在BUB1缺陷细胞中，像冷休克、噻喏哒唑、紫杉醇和17一烯丙基氨基格尔德霉素（17-AAG），可以激活纺锤体检查点，导致有丝分裂早期DNA断裂形成。这种有丝分裂细胞死亡不依赖CASPASE活化，称为CASPASE非依赖有丝分裂死亡（CASPASE-independent mitotic death，CIMD）。噻喏哒唑、紫杉醇或17.AAG处理来自染色体不稳定的结肠肿瘤，可导致CIMD,而对于来自微卫星不稳定的结肠肿瘤无此作用。此结果是由于前者BUB1低表达。当BUB1功能完全消除后，则出现的是非整倍体而非CIMD.这些结果说明，倾向于染色体错误分离的细胞可能通过CIMD而清除。上述研究表明，纺锤体检查点参与了肿瘤化疗药物杀伤肿瘤细胞的机制。

　　目前虽有许多研究表明，微管抑制剂等抗肿瘤药物通过纺锤体启动了有丝分裂灾变、凋亡等通路而使肿瘤细胞死亡，但纺锤体检查点在抗肿瘤治疗中的活动表达的多样性。表现出其对肿瘤药物的不同效应。有研究表明，高浓度紫杉醇允许MAD2定位于着丝点。低浓度紫杉醇处理的细胞由于纺锤体检查点失活而从有丝分裂阻滞逃逸。导致异常有丝分裂及异倍体。而经过≥20 nmol/L高浓度紫杉醇处理16 h后，MAD2-P55CDC复合体显着增加，而8 nmol/L的紫杉醇则未出现此现象。而导致MAD2-P55CDC复合体形成的药物浓度与有丝分裂阻滞有关，据此可推测，≥20 nmol/L的紫杉醇通过MAD2-P55CDC复合体的形成来阻滞有丝分裂。此研究表明，紫杉醇等化疗药可能通过浓度依赖性机制影响纺锤体检查点蛋白的不同表达而呈现不同毒理作用【17】 。

　　Fu等【18】以人卵巢癌细胞系SKOV3为亲本细胞，用中等剂量间歇作用结合低剂量持续作用法诱导建立耐紫杉醇细胞模型SKOV3-T,R30,研究发现，耐药细胞亚系BUBR1表达量明显低于亲本细胞，提示纺锤体检查点部分功能缺失可能有助于其对抗肿瘤药物的不敏感性。Tanaka等【19】报道低表达MAD2和BUBRI的食管鳞状细胞癌细胞系对紫杉醇和多烯紫杉醇更敏感，提示纺锤体检查功能减弱的细胞系增强了对微管抑制剂的敏感性。两者结果的不同可能与癌细胞来源于具有不同遗传背景的组织有关，或纺锤体检查点在细胞有波动范围，只有超出（上升或下降）某界值时才会出现不利于细胞自身功能的异常变化。

　　过表达的纺锤体检查点蛋白亦影响了细胞对微管抑制剂的敏感性。过表达MAD2的鼻咽癌细胞对长春新碱敏感，在较低程度上，对紫杉醇亦敏感【20】 。

　　展 望

　　近年研究表明，纺锤体检查点可监控染色体精确分配、维持基因组稳定性，而其功能缺陷导致非整倍体、细胞功能异常的作用逐步明确。同时发现，纺锤体检查点表达失衡（上调或下调）参与了肿瘤化疗药物的药理机制，而探讨上调与下调间的度--即维持细胞正常增殖的检查点蛋白表达的量的范围，将进一步深入理解细胞周期转变控制机制，有助于发现新的杀灭肿瘤细胞的靶向化疗药物。目前，纺锤体检查点在妇科肿瘤领域的研究亦逐渐展开。

　　参 考 文 献

{NextPage}　　【1】 Santaguida S,Musacchio A.The life and miracles of kinetochores[J].EMBO J,2009,28（17）：2511-2531.

　　【2】 Ciliberto A,Shah JV.A quantitative systems view of the spindle assembly checkpoint[J].EMBO J,2009,28（15）：2162-2173.

　　【3】 Tanaka TU,Desai A.Kinetochore-microtubule interactions:the meanstothe end[J].CurrOpinCellBiol,2008,20（1）：53-63.

　　【4】 Yang M,Li B,Liu CJ,et a1.Insights into mad2 regulation in the spindle checkpoint revealed by the crystal structure of the symmemc mad2 dimer[J].PLoS Biol,2008,6（3）：e50.

　　【5】 Kuhkian A,Han JS,Cleveland DW.Unattached kinet~hores catalyze production of an anaphase inhibitor that requires a Mad2 template to prime Cdc20 for BubR1 binding[J].Dev Cell,2009,16（1）：105一l17.

　　【6】 Burum-Auensen E,Skotheim RI,Schjolberg AR,et a1.Spindle proteins are differentially expressed in the various histological subtypes oftesticulargerm celltumors[J].JCarcinog,2010,9:1-9.

　　【7】 Carter SL,Eklund AC,Kohane IS,et a1.A signature of chromosomal instability infe~ed from gene expression profiles predicts clinical outcome in multiple human cancers[J].Nat Genet,2006,38（9）：1043-1048.

　　【8】 Yao Y,Chen Y,Wang Y,et a1.Molecular classification of human endometrial cancer based on gene expression profiles from specialized mieroarrays[J].Int J Gynaecol Obstet,2010,110（2）：125-129.

　　【9】 Jeganathan K,Malureanu L,Baker DJ,et a1.Bubl mediates cell death in response to chromosome missegregation and acts to suppress spontaneous tumorigenesis[J 3.J Cell Biol,2007,179（2）：255-267.

　　【10】 Perez de Castro I,de Carcer G,Malumbres M.A census of mitotic cancer genes: new insights into tumor cell biology and cancer therapy[J].Carcinogenesis,2007,28（5）：899-912.

　　【11】 Hernando E,Nahl6 Z,Juan G,et a1.Rb inactivation promotes genomie instability by uncoupling cell cycle progression from mitotic control[J].Nature,2004,430（7001）：797-802.

{NextPage}　　【12】 Lo YL,Yu JC,Chen ST,et a1.Breast cancer ri;k associated with genotypie polymorphism of the mitotic checkpoint genes:a multigenie study on cancer susceptibility[J].Carcinogenesis,2007,28（5）：1079-1086.

　　【13】 Park HY,Jeon YK,Shin HJ,et a1.Differential promoter methylation may be a key molecular mechanism in regulating BubR1 expression in cancer cells[J].Exp Mol Med,2007,39（2）：195-204.

　　【14】 Yamada HY,Gorbsky GJ.Spindle checkpoint function and cellular sensitivityto antimitotic drugs[J].MolCancerTher,2006,5（12）：2963-2969.

　　【15】 Huang HC,Shi J,Orth JD,et a1.Evidence that mitotic exit is a better cancer therapeutic target than spindle assembly[J].Cancer Cell,2009,16（4）：347-358.

　　【16】 Niikura Y,Dixit A,Scott R,et a1.BUB1 mediation of caspase-in-dependent mitotic death determines cell fate[J].J Cell Biol,2007,178（2）：283-296.

　　【17】 Ikui AE,Yang CP,Matsumoto T,et a1.Low concentrations of taxol cause mitotic delay followed by premature dissociation of p55CDC from Mad2 and BubRl and abrogation of the spindle checkpoint,leading to aneuploidy[J].Cell Cycle,2005,4（10）：1385-1388.

　　【18】 Fu Y,Ye D,Chen H,et a1.Weakened spindle checkpoint with reduced BubR1 expression in paclitaxel-resistant ovarian carcinoma cell line SKOV3一TR30[J].Gynecol Oncol,2007,105（1）：66-73.

　　【19】 Tanaka K,Mohri Y,Ohi M,et a1.Mitotic checkpoint genes,hsMAD2 and BubR1,in oesophageal squamous cancer cells and their association with 5-fluorouracil and cisplatin-based radiochemotherapy[J].Clin Oncol（R Coll Radio1），2008,20（8）：639-646.

　　【20】 Wang X,Jin DY,Wong HL,et a1.MAD2-induced sensitization to vineristine is associated with mitotic arrest and Raf,Bcl-2 phospho-rylation in nasopharyngeal carcinoma cells[J].Oneogene,2003,22（1）：109-116.