【摘要】  流行病学和分子生物学资料表明，人乳头瘤病毒(HPV)的感染能够引起子宫内上皮样瘤变(CIN)及宫颈癌的发生。并且HPV的不同型别致病力也存在差异,高危型别、高病毒载量的持续感染是促使宫颈癌发生的重要因素。因此，HPV感染的早期发现、准确分型及病毒定量对宫颈癌的防治具有重要意义。作者对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行综述。

  【关键词】  人乳头瘤病毒; 聚合酶连反应; 实时荧光定量; 分子信标; 文献综述

　人乳头瘤病毒(human papillomavius，HPV)是促使子宫内上皮样瘤变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)及宫颈癌发生的已知的重要因素[1-2]。德国学者Harald zur Hausen因发现了HPV与宫颈癌之间的关系获得了2008年诺贝尔生理或医学奖。HPV具有多种型别，分为高危型和低危型，不同的型别致癌潜能存在差别。高危型、高病毒载量的持续感染可以引起宫颈癌的发生[3]。2009年5月召开的第25届国际乳头瘤病毒会议，说明了全球HPV的感染率呈上升趋势，并且出现了新的基因型别[4]。在我国，宫颈癌的发病率也呈上升趋势并且趋于年轻化，因此，HPV感染的检测、病毒定量、基因分型对临床宫颈癌的防治具有重要意义。在相关资料的基础上，我们对HPV基因的检测和分型方法如核酸杂交、PCR、荧光定量PCR等，以及各方法的优缺点进行了系统的综述，以期进一步建立可靠、简便、快速的HPV检测、定量、分型方法。

　　1 HPV的结构

　　HPV为双链环状DNA病毒，基因组约8 000 bp，分为早期编码区(early region)、晚期编码区(late region)、非编码区(noncoding region)，含8个可译框(open reading frame，ORF)，其中早期ORF 6个、晚期 ORF 2个。它属于无包膜病毒，由DNA核心和衣壳组成，结构示意图如图1。

　　图1 HPV基因组结构示意图

　　Fig 1 Schematic of HPV genome

　　2 HPV的分型

　　HPV根据生物学特征、致癌潜能可分为高危型(high risk)和低危型(low risk)。HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68属于高危型，HPV6、11、42、43、44属于低危型[5]。高危型整合于细胞基因组中，与宫颈癌的发生密切相关;低危型不整合于细胞基因组中，主要引起疣的发生。

　　3 HPV的检测及分型方法

　　HPV不能体外培养，其检测主要是基于HPVDNA的分子生物学方法。

　　3.1 HPVDNA的核酸杂交检测

　　核酸杂交检测主要包括核酸印迹(Southern blot)、原位杂交(in situ hybridization，ISH)、杂交捕获(Hybrid Capture, HCⅡ)。早期，HPV的检测主要是应用核酸印迹、ISH。核酸印迹是HPV基因分型的金标准，适用于其基因分型和HPVDNA分子质量分析，但灵敏度较低、操作复杂，需用新鲜的组织标本，用福尔马林等固定剂固定的组织中，DNA可发生交联或降解，从而影响杂交结果;ISH虽可进行定位，但特异性低。因此大大限制了它们在临床的应用。

　　HCⅡ是Digene公司建立起来的一种非放射性的分子杂交化学发光信号放大系统。样品HPVDNA双链被释放并分解为可杂交的核苷酸后，单链标记的固相化的RNA探针与目标HPVDNA杂交，DNARNA的杂交信号在固相载体上转化为免疫结合，由标记碱性磷酸酶的抗体介导产生化学发光信号。HCⅡ是目前唯一被美国食品药品管理局(FDA)批准用于临床HPV筛查的方法[6]。HCⅡ能够区分HPV的高危型和低危型，但不能确定其具体型别。有时探针之间存在交叉反应[7]，并且敏感度低于PCR方法。尽管如此，它无需基因扩增，降低了实验污染的可能性;较之PCR方法，其假阳性、假阴性率均较低。作为一种筛查方法，HCⅡ法在临床仍得到了广泛应用[6]。

　　3.2 HPVDNA的PCR检测

　　PCR是20世纪80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点，能在一个试管内将所要研究的目的基因或DNA片段于数小时内扩增十万乃至百万倍,扩增出的足量DNA产物供分析研究和检测鉴定，从而提高了HPV感染的检出率。基于PCR衍生出了多种用于HPV检测和分型的方法。

　　3.2.1 型特异引物PCR

　　型特异性PCR (type specific PCR )是利用型特异引物，对组织标本提取的HPVDNA进行特异性的扩增，而后凝胶电泳进行检测和分析，从而判断感染与否及感染的型别。但是，单管只能检测1种基因型，多重PCR需多管分别进行。该方法耗时费力并且较为昂贵，不为临床所采用。

　　3.2.2 通用引物PCR

　　通用引物介导的PCR (general primer mediated PCR)利用通用引物实现广谱HPV的扩增，采用多种方法对扩增产物进行分析，实现HPV的基因分型。

　　引物设计针对HPV各型别间的保守区域。在HPV基因组中L1区最为保守，因此目前常用的通用引物大都针对L1区。如GP5+/6+，可扩增150 bp，该体系需较低的退火温度;MY09/11及其改良的PGMY，可扩增450 bp，该体系无需较低的退火温度;SPF10，可扩增65 bp，不含简并碱基但是含有黄嘌呤，黄嘌呤可以和任意碱基配对，因此引物重复性好，可在优化的退火温度下进行，提高了PCR扩增效率[8]。可根据实际情况选择不同的引物。{NextPage}

　　通用引物PCR的扩增产物可用直接测序法、限制片段长度多态性分析、反向杂交、基因芯片实现基因分型。

　　3.2.2.1 直接测序法 直接测序可以检测包括少见型别和新型别在内的HPV所有基因型别，尤其对同源性差的HPV基因型能提供强的序列信息，并可提供已知HPV型别的突变信息,是一种较为可靠的方法。但该方法费时、昂贵，并且HPV混合感染时检测灵敏度不高，限制了其在体外诊断中的应用。

　　3.2.2.2 限制片段长度多态性分析(restriction fragment length polymorphism,RFLP) 采用的限制酶大多为BamHⅠ、DdeⅡ、HaeⅢ、HinfⅠ、PstⅠ等。不同的HPV型别具有不同的序列、限制性酶切位点，当用限制酶酶解DNA时，产生不同的限制性片段，因此不同的型别呈现不同的电泳条带模式，据此可判断HPV型别。该方法相对简单，无需特殊仪器设备并且费用较低。因非特异产物影响酶切后分型的判断，因此RFLP要求PCR产物具有较高的纯度。

　　3.2.2.3 反向杂交 反向杂交是PCR扩增产物与多个固相化的寡核苷酸探针进行杂交。探针最常为平行线性排列，因此常称之为线性平行杂交(line probe assay，LiPA;line blot assay，LBA;liner arry，LA)[8]。基本原理为：将多个探针平行固相化于一个膜内，用生物素标记的引物扩增目的基因片段，双链PCR扩增产物在碱性条件下变性后加入固定有探针的膜，然后进行杂交、洗涤，最后依次加入链霉素生物素复合物和底物进行显色，根据探针条带上紫红色沉淀判断对应基因型别。该方法用样量少、灵敏度高，可同时分析HPV混合感染中的不同型别。

　　除反向杂交外，HPV PCR产物还可应用微孔板杂交。基本原理为：引物5′端标记生物素，PCR扩增后将产物与已包被亲和素的微孔板结合，与荧光素标记的特异性探针杂交，然后用酶标的抗荧光素抗体与其结合进行显色反应，最后通过测定吸光度值进行分析。该方法实现了微孔板模式下的高通量，并且比HCⅡ更为灵敏;PCR扩增后产物又进行了杂交，确保了检测的特异性，降低假阳性的发生;适合于区分HPV阳性和阴性，可以作为HPV分子诊断的首步[9]。但该方法需要各型的特异性探针用以分型[10]。该方法直接检测的是HPVDNA，只要组织标本内含有HPVDNA即可产生阳性信号，但阳性信号只能说明既往感染，并不能证明疾病的现状、病毒的致病性等。

　　3.3 HPV DNA的实时荧光定量PCR检测

　　实时荧光定量PCR是在传统的PCR技术上发展起来的核酸定量技术。1996年由美国Applied biosystems公司推出，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的累积实时监测PCR反应进程，通过Ct值和标准曲线对样品目标核苷酸定量。反应在96孔板中进行，无需在凝胶上分析产物，省去了PCR扩增后的后续操作。PCR的扩增和扩增产物分析全程均在单管密闭条件下进行，解决了PCR的污染问题;重复性好、快速，适合临床应用。由于不同荧光素的应用，可以进行多重PCR，同时检测不同的目标DNA。实时荧光定量 PCR 的化学原理包括非探针类和探针类两种。非探针类是利用荧光染料或者特殊设计的引物来指示扩增的进行;探针类是利用与靶序列特异杂交的探针来指示扩增产物的进行。综合检测的效率、准确度、操作的复杂性等各方面，实时荧光定量PCR是检测HPV的一种简便、快捷的方法。

　　3.3.1 SYBR Green法

　　SYBR Green是一种能够非特异性结合双链DNA小沟的、高灵敏度的荧光染料。在PCR反应体系中，加入过量的SYBR Green荧光染料，随着PCR的进行双链DNA逐渐增加，发射的荧光信号也随之增加，通过检测荧光强度的变化进行目的DNA的定量。

　　Draganov等[11]应用此方法结合通用引物MY09/10进行了HPV的筛查和定量检测，阳性结果利用型特异引物进行分型，检测了HPV6、11、16、18、31、33共6种型别，但型别的检测需各引物在不同的管内分别进行。Rodrigues等[12]利用通用引物GP5+/6+结合SYBR Green进行了HPV的检测，该方法采用Tm值和Ct值的结合进行定性和定量，实现了HPV筛查和定量的同时进行，减少了每个样本的平行操作，灵敏度高，适用于大样本筛查。该方法可以检测任意双链DNA的扩增，无需特异性的探针，较其它的实时荧光定量方法简单、成本低，并可以快速微量检测，但不能区分出具体型别，如进一步确定型别需后续的分析检测。由于SYBR Green能和任何双链DNA嵌合，当反应体系内存在非特异性扩增产物、引物二聚体等时，将会产生假阳性结果。

　　3.3.2 TaqMan探针法

　　利用各型HPV DNA的GenBank序列设计型特异引物、TaqMan寡核苷酸探针。探针5′末端标记荧光报告基团(如FAM)，3′末端标记荧光猝灭基团(如TAMRA)。当完整探针与靶序列配对结合时，荧光基团发射的荧光被3′端的猝灭剂猝灭;但当PCR延伸反应进行时，Taq酶5′核酸外切酶活性可将探针酶切，使得荧光基团与猝灭基团分离从而发射出荧光，并且荧光强度与扩增产物的量呈正比。Lindh等[13]利用TaqMan探针法检测14种HPV型别，但各个型别需分别在不同的管内进行。针对一些方法不能检测HPV52型，Stevens等[14]设计了HPV52型别特异性TaqMan探针，能够从多重感染中检测出HPV52。Schmitz等[15]利用多重定量TaqMan探针法检测了临床常见的7种高危HPV型别，反应分两管进行。该方法对探针和引物的设计要求较高，且多重PCR反应的进行技术难度较大，费用也较高，不适合高通量的检测。

　　3.3.3 分子信标法(molecular beacons)

　　分子信标是一种在靶DNA不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。环部分和靶核酸互补结合，探针两端由于碱基互补形成茎。无靶序列存在时，荧光基团与猝灭基团相互靠近，发生荧光共振能量转移，荧光猝灭，背景信号极低;靶序列存在时，分子信标与靶序列互补结合，探针的颈部打开形成单链，与靶序列形成稳定的双链杂交体，荧光基团与猝灭基团分离，分子信标构象发生改变从而荧光得以释放。

　　GenoID和Semmelweis 大学的微生物学、病理学系的科学家Takacs等[16]采用基于分子信标的一步多重PCR体系可同时检测HPV 15种高危型别和5种低危型别。高危型、低危型、内标分子信标分别采用3种不同激发波长的荧光基团进行标记，在相应的不同波长处检测信号。与TaqMan探针法相比，其特异性优于线性探针，具有更好的灵敏度和荧光信号值[17]。分子信标法已经被作为HPV检测的一种新的实时荧光定量PCR方法，单管反应即可实现多重的、高灵敏度的检测，其快速、高效，一步反应即可完成。但该方法对分子信标探针的特异性要求较高。

　　与分子信标类似的检测还有蝎形引物介导的实时荧光定量PCR，其有效性仍需进一步验证及改进，而其检测费用较高，限制了其在临床的应用。

　　3.4 基因芯片(gene chip)技术

　　基因芯片即生物芯片(biochip)、微阵列(Microarray)或DNA芯片(DNA chip)，通常指DNA芯片。其基本原理是将指大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号的强弱进而判断样品中靶分子的数量。基因芯片集成了探针固相原位合成技术、照相平板印刷技术、高分子合成技术、精密控制技术和激光共聚焦显微技术，使得合成、固定高密度的数以万计的探针分子以及对杂交信号进行实时、灵敏、准确的检测分析变得切实可行。基因芯片具有微型化、集约化和标准化的优点。目前已经有用于HPV分型检测的商业化的基因芯片，大都属于专利技术。HPV寡核苷酸探针固相化于DNA芯片上，与PCR产物杂交能够区分一个标本中的多种型别[18-19]，适合高通量HPV筛查。与其它方法相比，它具有很好的灵敏度和特异性，但是型特异的检测需要进一步标准化[20]。

　　4 总结与展望

　　综上所述，HPV的检测及分型方法主要基于PCR、PCR与核酸杂交等方法的结合、实时荧光定量PCR和基因芯片。较传统细胞形态学检测，它们均表现出了较高的特异性和灵敏度。尤其是实时荧光定量PCR检测，除具有较高的特异性和灵敏度外，还实现了检测、定量、分型的同步进行，检测简便快速;但其检测费用也较高，实验条件要求较高，目前大都处于实验室阶段，不适合大规模HPV筛查和流行病学研究。因此，建立一种简便快速、具有较高灵敏度及特异性同时检测费用较低的HPV检测方法尤为必要。随着分子生物学技术的不断进步，理想的HPV的分型检测技术将会应用于实践，对于整个人群HPV感染的流行病学研究及防治具有重要意义。