【摘要】目的:探讨人类白细胞抗原-G(HLA-G)对滋养细胞增殖功能的调节 。方法:实验分为3组:用滴度为5×108pfu/ml腺病毒感染液转染JEG-3细胞为目的siRNA组,用滴度为109pfu/ml腺病毒感染液转染JEG-3细胞为非特异siRNA组,不产生siRNA的空病毒感染组为空白对照组.采用RNA干扰技术,下调JEG-3细胞中HLA-G基因的表达,对HLA-G降调节后的滋养细胞进行非放射性细胞毒测定,检测490nm处的OD值,比较3组的染色实验结果和比色实验结果。结果:①实验后目的siRNA组与非特异siRNA组细胞蓝染,实验后空白对照组细胞没有被蓝染;②非特异siRNA组写空白对照组OD490nm值比较,两组之间差异无统计学意义(q=3.15,P＞0.05);目的siRNA组与非特异siRNA组、空白对照组OD490nm值比较,差异均有统计学意叉或高度统计学意义(q=3.92,P＜0.05;q=5.58,P＜0.01)。结论:HLA-G表达下调后滋养细胞增殖受到抑制,推测HLA-G可能对滋养细胞增殖功能有维持、促进作用。

【关键词】人类白细胞抗原-G；细胞增殖；RNA干扰

　　人类白细胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)是位于人第6号染色体短臂上的一群紧密连锁基因群，属于人类一种非经典的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的I类分子，选择性高表达于侵入子宫蜕膜的绒毛外滋养细胞。妊娠被认为是成功的同种异体移植，很多妊娠相关疾病与滋养细胞异常增殖、浸润、胎盘形成不良有关。
HLA-G在母胎界面的表达对母胎免疫耐受和维持正常妊娠有重要作用，但HLA-G的具体生物学作用，尤其是非免疫学功能仍不明确。本研究采用RNA干扰(RNAi)技术，通过我室已构建的针对HLA-G基因的siRNA重组腺病毒载体转染HLA-G高表达的人绒毛膜癌细胞株JEG-3，观察HLA-G表达水平的变化对滋养细胞分裂生长的影响。通过HLA-G对滋养细胞增殖调节作用的研究，发现HLA-G新的非免疫学功能。

1　材料与方法

1.1　材料　人绒毛膜癌细胞株JEG-3来源于ATCC(manassas，VA，USA.)，DMEM／F12购自Gibco(USA)。CytoTox96Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒购自Promega公司。

1.2　细胞培养　JEG-3细胞常规培养于含50U／ml青霉素和50μg／ml链霉素和10％胎牛血清(FBS)的DMEM／F12　1：1(Gibco，usA)培养液中，37％、5％co2：培养箱中培养。每2～3天用含0.25％胰酶及0.03％EDTA的消化液消化细胞，取对数生长期的JEG-3细胞进行转染。

1.3　实验分组　目的siRNA组：用滴度为5×108pfu／ml腺病毒感染液转染JEG-3细胞；非特异siRNA组：用滴度为109pfu／ml腺病毒感染液转染JEG-3细胞；空白对照组：不产生siRNA的空病毒感染组。{NextPage}

1.4　转染JEG-3细胞

1.4.1　配制3个实验组病毒混合培养液　所需腺病毒液量(ml)=汇合度×6o％×MOI值÷腺病毒液滴度。96孔板每孔所需培养液量为0.1ml，根据以上公式计算得到的所需腺病毒液量+完全培养液：0.1ml。

1.4.2　转染JEG-3细胞　分别用已配制的腺病毒混合培养液代替完全培养液培养JEG-3细胞4小时，然后弃去病毒液并洗净更换新鲜培养液继续培养48小时。

1.5　X－Gal染色实验

1.5.1　配制X－Gal溶液100mmol／L磷酸钠，pH7.3(77mmol／LNa2HPO4，23mmol／L NaH2P04)，1.3mmol／L MgCI2，3mmol／LK3Fe[CN]6，3mmol／LK4Fe[CN]6，1mg／ml X-Gal。0.45μm过滤膜过滤。

1.5.2　实验步骤　弃去培养皿中完全细胞培养液，4％多聚甲醛4℃冰箱固定30分钟后PBS液洗细胞。加入X－Gal溶液50μl，使其完全覆盖细胞，避光，放入37℃培养箱。监控蓝染进程(从30分钟至过夜)细胞着色后镜下计数蓝染细胞确定感染效率。

1.6　比色实验　按照CytoTox 96 ®Non-Radioactive Cy-totoxicity Assay试剂盒说明书操作，感染病毒后的细胞继续培养48小时后，加入裂解液，取适量裂解细胞上清加入试剂显色，终止反应后490nm比色，OD值代表细胞的相对数量。

1.7　统计分析　实验数据以均数±标准差(±s)表示，使用SPSS13.0统计软件对数据进行分析，多组均数两两之间的全面比较采用SNK-q检验，检验水准口α=0.05。

2　结果

2.1　JE3细胞X－Gal染色实验结果　实验后目的siRNA组(图1B)与非特异siRNA组细胞蓝染(图1c)，实验后空白对照组细胞没有被蓝染(图1D)；实验后目的siRNA组(图1B)细胞数量最少，实验后空白对照组(图1D)细胞数量最多。X－Gal染色实验前JEG-3细胞(图1A)。图lA、B、C、D(见插页5－1)。{NextPage}

2.2　JEG-3细胞比色实验结果　目的siRNA组0D490 nm=2.368±0.187；非特异siRNA组OD490nm=2.681±0.163；空白对照组OD490nm=2.725±0.237。目的siRNA组与非特异siRNA组和空白对照组比较，差异均有统计学意义或高度统计学意义(q＝3.92，P<0.05；q=5.58，P<0.01)；非特异siRNA组与空白对照组比较，两组之间差异无统计学意义(q=3.15，P>0.05)。

3　讨论

　　HLA－G是由Geraghty于1987年首次克隆出来的位于6号染色体短臂的一类免疫耐受分子[1]，具有选择性组织分布的特点，表达于母胎界面绒毛外滋养细胞、一些肿瘤细胞系、肿瘤活检组织和一些感染及正常组织细胞，以及心脏移植后的移植物细胞等[2] 。既往对HLA-分子生物学功能的研究主要集中于HLA-G分子对免疫细胞的作用及机制研究，很少深入研究HLA-G分子对于滋养细胞功能的影响[3]。

　　本实验首次对HLA-G的非免疫学功能进行研究，进行了染色实验及比色实验。以往研究表明滋养细胞表面有柯萨奇一腺病毒受体(coxsacke vires and adenovirus receptor，CAR)表达，腺病毒载体可高效转染滋养细胞，该载体最适感染复数MOI=100[4] ，可达到100％感染效率，并且对细胞毒性较小。本研究采用RNAi技术，使用我室成功构建的腺病毒载体[4]瞬时转染
HLA-G高表达的JEG-3细胞，下调滋养细胞中的HLA-G表达[5] ，通过X-Gal染色实验发现，目的siRNA组与非特异siRNA组细胞均被蓝染，说明细胞可100％被腺病毒转染，分别产生目的siRNA及非特异siRNA。空白对照组细胞没有被蓝染，说明细胞没有被腺病毒感染，不产生siRNA。比色实验结果：目的siRNA组与非特异siRNA组490nm值比较，两组之间差异有统计学意义(q=3.92，P<0.05)，说明腺病毒载体转染JEG-3细胞后，使细胞增殖减少；目的siRNA组与空白对照组0D490nm值比较，两组之间差异有高度统计学意义(q=5.58，P<0.O1)，而非特异siRNA组与空白对照组490nm值比较，两组之间差异无统计学意义(q=3.15，P>0.05)，研究结果可以排除转染后不产生siRNA的空病毒载体对JEG-3细胞增殖的影响。本实验可以说明HLA-G低表达的滋养细胞的分裂增殖会受到抑制，表明HLA-G对滋养细胞的增殖有维持、促进作用。但HLA-G的功能研究的分子机制及信号通道还不清楚，尚需进一步研究。

　　研究表明在试管婴儿技术中，HLA-G表达水平低的胚胎其着床率较低[6,7] ；HLA-G的表达下降与某些病理性妊娠如胎盘早剥[8] 、子痫前期及复发性流产[9～11] _的发病相关；另外该分子在肿瘤发生与抗移植物排斥反应中也具有重要作用。目前，通过RNAi抑制某些基因表达从而治疗肿瘤已成为基因治疗研究的相关热点，本实验在体外将针对HLA-G基因的siRNA重组腺病毒载体成功转染了人绒癌细胞，构建了HLA-G降调节模型，并且成功抑制了绒癌细胞的增殖，为RNAi技术在肿瘤的基因治疗中的进一步应用提供了重要的实验基础。实验表明HLA-G对滋养细胞的增殖功能具有调节作用，推测子痫前期与复发性流产等病理性妊娠过程中，HLA-G的降低可能通过抑制滋养细胞的增殖功能从而参与了疾病的病理生理过程。本研究为深入研究HLA-G的非免疫学功能奠定了理论基础，同时为深入研究子痫前期等病理性妊娠的发病机制提供了依据。

参考文献：略。{NextPage}