宫颈癌发病率居妇科恶性肿瘤首位，近年来，在发展中国家发病率有上升趋势[1] 。宫颈上皮内瘤变（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）作为宫颈癌癌前病变，以其病理发展过程可分为CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ级，目前认为，CINⅠ级几乎不发生癌变，20％～45％未治疗的CINⅡ及CINⅢ患者可能发生癌变。细胞凋亡的发生可能是由于诱导凋亡的凋亡配体如Fas抗原配体（FasL）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)与细胞表面的凋亡受体如Fas抗原、死亡受体DR4和DIL5结合而导致的凋亡通路激活[3] 。TRAIL有4种受体(TRAIL-R)：TRAIL-R1(即死亡受体DR4)、TRAIL-R2(即死亡受体DR5)、TRAIL-R3和TRAIL-R4，DR4和DR5有凋亡诱导活性，后两者可以与TRAIL结合但没有活性[4] 。本研究采用免疫组化法探讨宫颈癌变的不同阶段凋亡受体和凋亡配体(Fas、FasL、DR4、DR5、TRAIL)的表达与细胞增殖和凋亡的关系，探讨其在宫颈癌变中的作用。

一、材料与方法

1．材料来源：所有组织样本均来自华中科技大学同济医学院附属协和医院2003年7月至2005年9月宫颈活检、环形电切术(LEEP)和子宫手术切除的宫颈组织225份。患者年龄21～68岁，平均年龄43岁，CINⅠ患者50例，平均年龄41岁，CINⅡ40例，平均年龄37岁，CINⅢ45例，平均年龄46岁，宫颈癌患者40例，平均年龄51岁。作为正常对照的正常宫颈鳞状上皮组织50份，来自因子宫平滑肌瘤或子宫腺肌病而切除的子宫标本，经病理检查证实官颈上皮无异常改变。CIN的诊断按照《妇产科学》(第6版)的标准，宫颈癌的诊断参照文献[5] 。

2．标本制备：所有组织样本均经4％中性甲醛溶液固定，石蜡 包埋，连续切片5张，厚度3～4μm，1张行HE染色，进行分类诊断，由3位有经验的病理医师对全部样本的病理诊断进行复查，诊断一致的病例方纳入研究样本；3张用于免疫组化染色；另1张备用。

3．免疫组化染色及细胞形态学观察：采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶(SP)连接法检测FasL、Fas、TRAIL、DR4、DR5和细胞增殖相关核抗原Ki-67的表达；采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸标记法(TUNEL)观察凋亡细胞。免疫组化染色中，FasL和Fas鼠抗单克隆抗体(单抗，美国ADI公司产品)实验液稀释浓度为1:50，DR4和DR5单抗实验液稀释浓度分别为1：100(美国One Lambda公司产品)，TRAIL单抗实验液稀释浓度为1:80(美国Zymed公司产品)；抗原修复以枸橼酸盐缓冲液，行高压锅加热修复法；每次染色均设已知的宫颈癌阳性标本作为阳性对照，用0.1mol／L枸橼酸盐缓冲液代替单抗作为阴性对照。实验步骤严格按试剂盒说明书进行。{NextPage}
4．结果判定：FasL、Fas、TRAIL、DR4、DR5和Ki-67的阳性着色定位于细胞核、细胞质和细胞膜，镜下见棕黄色的染色为阳性。从阳性染色强度和阳性表达率两方面进行双盲法观察与记分；染色强度分为：不染色为0分，可疑表达为1分，弱阳性表达为2分，阳性表达为3分，强阳性表达为4分；阳性表达率按百分率分别记分：<5％为0分，5％～25％为1分，26％～50％为2分，>50％为3分；最后得分为每个研究病例的染色强度和阳性表达率分数之和，最终分为3个级别：0～1分为阴性(-)，2～3分为阳性(+)，4～5分为强阳性(++)。高倍(400倍)视野下，若细胞质与胞核有不同染色为Ki-67阳性，计数200个细胞中Ki-67阳性细胞和凋亡细胞(体积缩小、核固缩、裂解)数，并记录Ki-67阳性细胞(即增殖细胞)和凋亡细胞占总细胞的百分率。

5．统计学方法：以SPSS11．5统计软件进行统计学处理，率的比较采用X2检验，均数的比较采用U检验。

二、结果

1．DR4、DR5和TRAIL在宫颈癌和CIN组织中的表达：DR4和TRAIL主要表达于细胞质内，DR5主要表达于细胞质靠近细胞核膜处。正常宫颈组织及CINⅠ组织中，DR4、DR5和TRAIL主要表达于分化良好的基底层和基底旁层细胞；CINⅡ、Ⅲ组织中，DR4可在病灶全层(基底层、基底旁层和表层)细胞表达；在宫颈癌组织中，病灶全层细胞均可见DR4和DR5表达。

2．各组织中的凋亡细胞和增殖细胞百分率：正常宫颈组织中，仅在基底层可见增殖细胞；CINⅠ～Ⅲ级组织中，增殖细胞百分率随着CIN级别升高而增加；宫颈癌组织中增殖细胞百分率低于CINⅢ级。CINⅠ～Ⅲ和官颈癌组织中，凋亡细胞百分率随着病变的严重程度加重而增加(x2=2.1，P<0.01)。CINⅢ和宫颈癌组织中，凋亡与增殖不平衡，宫颈癌组织中凋亡／增殖比(凋亡细胞百分率与增殖细胞百分率之比)显著高于CINⅢ组织，两者比较，差异有统计学意义(P<0.O1)。见表1。

3．宫颈癌和CIN组织中FasL、Fas的表达：FasL主要表达于基底层或基底旁层细胞的细胞核内。Fas主要表达于表层上皮细胞的核内。{NextPage}

三、讨论

　　目前，在宫颈癌变的不同阶段，有关FasL、TRAIL的表达和定位与细胞增殖或凋亡关系的研究未见报道。本研究结果显示，在CIN的不同阶段均有Fas、FasL、DR4、DR5和TRAIL的表达。在CINⅠ组织中，FasL、DR4、DR5和TRAIL主要表达于基底层和基底旁层上皮细胞，Fas主要表达于表层上皮细胞；在分化良好的组织中，FasL、DR4、DR5和TRAIL阳性表达率随着宫颈病变的严重程度升高而增加，Fas的表达随着CIN级别升高而降低，宫颈癌组织中阳性表达率显著降低。本研究提示，凋亡受体和凋亡配体在细胞凋亡过程中起重要作用，而凋亡受体和凋亡配体的表达水平与细胞凋亡无关，在CIN和宫颈癌病变过程中细胞仍具有增殖和凋亡的能力。

　　宫颈上皮细胞演变很快，资料显示，宫颈癌上皮细胞仅有35％的同质细胞，CINⅢ上皮细胞中仅有48％的同质细胞[6] 。Davidson等[7]报道，在同质的宫颈癌细胞样本中，上皮细胞增殖显著高于CINⅢ组织。通过TUNEL法检测宫颈癌组织，凋亡细胞百分率为1％一4％；以原位末端标记法(ISEL)检测CINⅢ和宫颈癌组织，凋亡细胞百分率分别为2％和4％[8] 。本研究应用TUNEL法进行检测，结果与上述报道基本一致。本研究结果表明，宫颈癌凋亡细胞百分率显著高于CINⅢ组织，说明宫颈癌上皮细胞DNA受损严重，含有此DNA的细胞更易发生凋亡。一般认为，CINIll病灶内未分化细胞增殖的百分率最高，分化较好的癌细胞均具有较高比例的细胞“失巢凋亡”现象，FasL和TRAIL凋亡配体与细胞表面Fas、DR4和DR5凋亡受体结合激活细胞凋亡，而在其他组织标本中，Fas、FasL、DR4、DR5、TRAIL表达水平与细胞凋亡无关。本研究显示，凋亡受体或凋亡配体的表达与细胞凋亡或增殖关系不密切，然而，在官颈病变的不同阶段，Fas与FasL的表达有显著变化，Fas的表达随着CIN级别升高而降低，宫颈癌和CINⅢ组织中Fas表达显著降低。

　　在正常宫颈组织和CINI组织中，增殖细胞主要在基底层和基底旁层，FasL在基底层和基底旁层连续表达可有效阻止Fas阳性的T淋巴细胞和粒细胞的侵袭，避免因FasL减少而导致的细胞凋亡。研究表明，CIN组织中，Fas表达和免疫监视增强，宫颈癌组织中，FasL表达显著高于CIN组织，而TRAIL[3]相反。目前认为，导致免疫细胞凋亡的关键因子是FasL。在本研究的正常宫颈组织和CINI组织中，DR4、DR5和TRAIL主要表达于基底层细胞，同时发现，TRAIL阳性表达率随着宫颈病变的加重而降低，提示TRAIL表达缺失在CIN到宫颈癌的变化中起重要作用。动物实验已证实，TRAIL缺失的鼠宫颈癌的发病率较高，TRAIL具有调控肿瘤生长的重要作用，TRAIL具有细胞杀伤性[8] 。

      总之，Fas丢失与FasL、DR4、DR5和TRAIL在由CIN到官颈癌过程中的不规则表达，表明这些凋亡受体和凋亡配体在宫颈癌变过程中起着功能性作用，细胞凋亡与增殖不平衡与宫颈癌变有关。{NextPage}

参考文献

［1］ Zanotti S, Fisseler-Eckhoff A, Mannherz HG. Changes in the topological expression of marker of differentiation and apoptosis in defined stages of human cervical dysplasia and carcinoma. Gynecol Oncol, 2003,89:376-384. 

［2］ Ashkenazi A. Targeting death and decoy receptors of the tumournecrosis factor superfamily. Nat Bey Cancer, 2002,2:420-430. 

［3］ Grossmann J. Molecular mechanisms of " detachment-induced apoptosis-Anoikis". Apoptosis, 2002, 7 : 247-260. 

［4］ Koornstra JJ, Rijcken FE, De Jong S, et al. Assessment of apoptosis by M30 immunoreactivity and the correlation with morphological criteria in normal colorectal mucosa, adenomas and carcinomas. Histopathology, 2004,44:9-17. 

［5］ Kuman RJ, Norris HJ, Wilkinson E, et al. Tumors of the cervix, vagina and vulva, tumors of the cervix//Bosai J. Arias of tumor pathology. 3rd ed. Washington DC: Armed Forces Institute of Pathology, 1992:37-39. 

［6］ Kase H, Aoki Y, Tanaka K. Fas ligand expression in cervical adenocarcinoma: relevance to lymph node metastasis and tumor progression. Gynecol Oncol, 2003, 90:70-74. 

［7］ Davidson B, Goldberg I, Lemer-Geva L, et aL Expression of topoisomerase Ⅱ and Ki-67 in cervical carcinoma-clinicopathological study using immunohistochemistry. APMIS, 2000,108:209-215. 

［8］ Hanselaar AG. Criteria for organized cervical screening programs. Special emphasis on The Netherlands program. Acta Cytol, 2002, 46:619-629.