卵巢不仅是女性的内生殖器官也是重要的内分泌器官。对于女性生育力和第二性征的维持具有重要的意义。女性肿瘤患者特别是年轻女性由于接受各种抗肿瘤治疗如手术、放疗、化疗，有可能会导致卵巢早衰甚至会切除卵巢从而导致终身不孕，丧失生育。目前保存女性生育力的方法主要有胚胎冷冻保存，卵母细胞冷冻保存和卵巢组织冷冻保存。相对于前两种方法卵巢组织冷冻保存有其优越性。对于那些因疾病必须切除卵巢，或必须行放疗、化疗可能损伤卵巢功能的女性患者，卵巢组织冷冻保存是保存生育力和内分泌功能的有效的方法，也是青春期前女孩保存生育力唯一的方法。对于那些需要立即进行癌症治疗的患者，卵巢组织冷冻可以不耽误治疗，也不要求卵巢刺激，因此在保存女性生育力方面具有巨大潜力。本文主要综述了近几年卵巢组织冷冻及应用的实验与临床研究。

      1．卵巢组织的冷冻
      早在上世纪50年代就有学者尝试冷冻动物卵巢组织，早期是把卵巢组织冻存于-79℃的环境中。1960年parrott用甘油作为冷冻保护剂冻融了鼠的卵巢组织并原位移植进鼠体内后有子代出生。1994年Gosden等用二甲基亚砜作为冷冻保护剂把羊卵巢组织储存于-196℃的液氮中，解冻
复苏后原位移植进羊体内，成功获得妊娠。羊卵巢的大小、组成、卵泡密度与人类相似，因此对人卵巢组织的冷冻保存有一定借鉴意义。1996年Newton等使用甘油、二甲基亚枫、乙二醇和丙二醇作为冷冻保护剂，把人类卵巢组织慢速冷冻一快速解冻后移植进SCID小鼠体内，观察对比卵巢组
织中原始卵泡的存活情况，结果证明冻融人卵巢组织移植后原始卵泡能很好的存活。目前冷冻卵巢组织应用最多的是慢速程序化冷冻和玻璃化冷冻方案。复苏多采用快速解冻的方法。

      (1)慢速程序化冷冻
      因为这种方法较为成熟，冷冻效果稳定，文献中多采用此法冷冻卵巢组织。但这种方法必需配备程序化冷冻仪，耗材较多。Donnez等2004年使用这种方法冷冻人类卵巢组织，原位移植后成功妊娠并产下一个婴儿，具体冷冻方法如下：将取出的卵巢组织皮质立即移人实验室放入Leibovitz培
养液中，切成2*2mm，厚1mm的小块。然后移人含冷冻保护液的预冷的冷冻管中，冷冻管放人程序化冷冻仪后按照下列步骤进行冷冻：1.以2℃／min的速度从0℃降温至-8℃；2.用在液氮中预冷的镊子接触冷冻管人工植冰；3.再以0.3℃／min的速度降至-40℃；4．然后以30℃／min的速度
降至-150℃；5．立即投入液氮内保存。也有人降至-140℃或-40℃时投入液氮中。

      (2)玻璃化冷冻
       玻璃化冷冻卵巢组织是近年来发展起来的冷冻保存技术，其基本原理是把卵巢组织置于高浓度的冷冻保护剂中经快速降温后，使细胞内外的液态直接转化为非晶体玻璃化状态，最大限度地减少细胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤。目前，玻璃化冷冻技术还处于实验阶段，没有形成标准化的程序，常用的冷冻保护剂主要有乙二醇(EG)、丙二醇(PROH)、二甲基亚枫(DMSO)、丁二醇(BD)、蔗糖(surcose)等。究竟哪种冷冻保护剂效果最好文献报道不一，现多采用多种冷冻保护剂联合使用的方案。LiYu—Bin等使用改良的玻璃化冷冻方案冷冻人的卵巢组织，结果表明玻璃化冷冻
组与慢速程序化冷冻组的卵泡存活率、分泌雌激素与孕激素的浓度无统计学差异。其方法如下：1．冷冻前先把组织条置于基础液(Ot—MEM液+12％的HAS+100IU／ml青霉素+100µg／ml链霉素)中培养5min；2．使用下述两步法使组织条脱水：首先把组织条置于含2.0 mol／LDMSO+0.1mol／L蔗糖的基础液中5min，然后把组织条移入含2.0 mol／LDM—
SO+2.0 mol／LPROH+0.2 mol／L蔗糖的基础液中5min； 3．之后组织立即被吸入巴氏吸管中然后轻轻摇晃巴氏管将其慢慢的滴入含液氮的小容器中； 4．然后用预冷的镊子收集固态小滴，将其密封进无菌的充满液氮的冷冻管中，投入液氮罐中储存。

      (3)卵巢组织的解冻
      卵巢组织解冻时常采用快速复苏的方法，即把盛有卵巢组织的冷冻管从液氮罐中取出室温中放置1min后投入37℃水浴中或直接投入37℃水浴中，轻轻摇晃直到冰几乎完全融化。然后把组织块快速依序移人含0.5moL／L，0.25moL／L，0.125mol／L蔗糖的基础液中室温下分别放置5min，以置换出细胞中高浓度的冷冻保护剂，再用新鲜培养液洗涤几次，留待下一步处理。

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      2．卵巢组织的应用
      采用目前的冷冻保存方案已能很好的使卵巢上的组织细胞得以保存，而如何使用冻融的卵巢组织已成为当前研究的热点。卵巢组织的应用主要集中在以下几个方面：①自体移植②异体移植③体外培养。

       (1)自体移植
      自体移植又分为自体原位移植和自体异位移植，理论上，如果输卵管完好的话，可以通过原位移植而获得自然妊娠。2000年，Okmy和Karlikaya报道了用腹腔镜把冻融的卵巢组织移植进一位29岁患者的盆腔，该患者切除了双侧卵巢。病人予移植后15周和6个月各接受了一次促性腺激素刺激，超声证明有卵泡发育并在注射HCG后发生了排卵。2004年Donnez J等首次报道了人冻融卵巢组织自体移植后成功妊娠并分娩出一个婴儿。2008年Donnez J等人报道了为五位因癌症治疗致卵巢早衰的妇女接受了原位自体移植冻融的卵巢组织手术，术后通过性激素的测定，超声监测卵泡以及恢复了月经来潮证明她们恢复了卵巢功能，但持续较高的FSH水平提示卵巢储备较差。原位移植大多是把不带血管蒂的卵巢组织移植进固有卵巢的附近，有学者发明了一种颏的原位移植的方法，使用大号注射针把兔的冻融卵巢组织直接注射进经大剂量放射线照射的兔的固有卵巢皮质中，移植后6个月内这些兔子均获妊娠。证明此法可以保存经大剂量放射线照射而损伤卵巢功能的兔的生育力，但作者同时指出此法的临床可行性仍需进一步研究确定。卵巢组织异位移植发现有卵泡生长已有报道。异位移植的部位包括直肠肌、腹壁皮下、前臂皮下、网膜等。异位移植的优点是移植物便于观察、移植或取出。但需行IVF—ET才能获得妊娠。2005年，Wolner—Hanssen等报道了把人冻融卵巢组织移植到前臂皮下，发现有2枚卵泡发育，但最大直径分别只有12.6mm和6.7mm。作者认为异位移植移植物有暴露于不适宜的温度和机械压力的可能，而与卵巢固有部位的温度和压力的不同有可能会影响异位移植物中卵泡的发育。2006年lsabelle Demeestere等报道了一例冻融卵巢组织原位和异位联合移植的病例，这位29岁身患霍奇金病的病人之前接受过骨髓移植及烷化剂等化疗药物的治疗，获得临床治愈但持续闭经，卵巢组织移植前的激素水平(FSH114mUI／ml，)证明该患者已经处于绝经期状态。在患者知情同意后，冻融的卵巢组织被原位移植进固有萎缩的卵巢切口内和近卵巢窝的盆腹膜中，同时一部分卵巢组织被异位移植进腹部皮下。观察发现除了盆腹膜部位的卵巢组织外其他部位的卵巢组织均有卵泡发育。经历6个月经周期后这名患者怀孕了但之后又不幸流产了。综上所述，自体移植冻融卵巢组织可以保存女性的生育力，有助于女性内分泌功能的恢复，但可能是由于移植物中卵泡的储备量非常有限以及可供移植的组织块数量有限，恢复卵巢功能后所能维持的时间都很短，因此建议在有生育要求时才为患者移植冻融的卵巢组织。

      (2)异体移植
      目前，由于卵巢组织的来源和免疫排斥反应的原因，人的同种异体移植卵巢组织尚存在许多难以解决的问题。国内研究胎儿卵巢组织移植的文献较多，因为胎儿卵巢的免疫原性弱，用胎儿卵巢为供体进行移植，有卑提高卵巢移植的成功率，但由于存在伦理问题国外关于胎儿卵巢组织移植的
报道很少。考虑到恶性肿瘤患者卵巢中可能存在微小残余病灶，自体移植卵巢组织有引起肿瘤复发和转移的危险。因此可以将冻融的癌症患者的卵巢组织异种移植进宿主动物体内，使卵泡生长成熟然后收集卵母细胞以保存患者的生育力。此法也可用于卵巢过度刺激的高危人群。异种移植一般选择免疫缺陷的动物作为异种移植的宿主，已有关于把人冻融卵巢组织移植进严重免疫缺陷(SCID)的小鼠体内并有卵泡发育的报道，Gook DA等驯观察到移植的冻融卵巢组织中卵泡发育到MⅡ期。关于异种移植的卵泡最终发育成熟以及卵母细胞的质量评估报道得还比较少。Kim等对于从异种移植的冻融人卵巢组织获得的人卵母细胞的完整性进行了评估，发现了有些卵母细胞表现出不正常的核和细胞质成熟。作者不能确定这些改变是不是与冻融对细胞的损伤、缺乏适合的卵巢刺激方案、动物宿主所提供的环境不是很好、体外培养技术不够成熟或是所选择的移植部位不适合有关。目前，对于异种移植中动物宿主的选择，异种移植是否会导致疾病的传播、基因的污染以及其存在的社会伦理问题都需要更深入的研究。2006年Israely等报道把15天龄鼠的卵巢组织异体移植进裸鼠的肉芽组织中，结果表明移植物的血管形成和卵泡存活率均有明显提高。作者指出卵巢组织移植过程中的缺血损伤所致的卵泡丢失要比冻融过程所致的损伤大，新鲜肉芽组织快速而大量的血管形成有助于卵巢组织血管的尽早重建从而减少缺血损伤。

      (3)体外培养
       为了避免移植卵巢组织引起肿瘤细胞的复发和播散，可以考虑把卵巢组织中的卵泡体外培养成熟。原始卵泡占整个卵巢储备的90％并且其对于冻融过程具有很好的耐受性，因此从原始卵泡期体外培养卵泡至成熟卵母细胞阶段相当具有潜力。已有人用机械分离和酶解的方法从新鲜和冷冻的卵巢组织中分离出原始卵泡，但目前还存在许多技术难题，完整分离人卵巢组织中的原始卵泡仍然很困难。由于尚缺乏体外培养原始卵泡的知识，目前还没有关于人类原始卵泡在体外培养至成熟卵母细胞阶段的报道。Segino M等从冻融的卵巢组织中机械分离出窦前卵泡，经体外培养12至16天后用HCG刺激，有卵丘一卵母细胞复合物从卵泡中排出，经体外受精后卵母细胞成功受精并能发育至囊胚阶段。Jun Liu等刮首先把新生鼠的冻融卵巢组织移植进受体鼠的肾包膜下，术后两周后，取出卵巢组织分离出窦前卵泡，然后把窦前卵泡在体外培养至成熟卵母细胞，经体外受精后胚胎发育至囊胚期，移植进鼠体内后有子代出生。证明在鼠体内移植冻融卵巢组织然后体外培养移植物中的卵
泡可以得到完全成熟的卵母细胞。这让我们联想到这种方法未来是否可以应用于人类。

       3．结论
      卵巢组织的冷冻给那些由于各种原因导致性腺功能受损的患者保存生育力和恢复内分泌功能带来了希望。但目前卵巢组织冷冻与应用领域仍存在很多问题：①寻找最佳的卵巢组织冻融技术，如确定适合冻融的最佳的组织块尺寸、研究最佳的冷冻保护剂的种类及浓度、确定玻璃化冷冻的标准化程序等。②自体移植的安全性问题，要强调对于那些恶性肿瘤患者，决定自体移植冻融卵巢组织前对卵巢组织进行多点活检和详细的组织学检查十分必要。同时移植物的寿命太短也限制了这项技术的临床应用。③异种移植技术尚不成熟，目前尚不能排除有导致疾病的传播及基因污染的可能。④寻找最佳的移植方法及移植部位。⑤目前的知识结构体系下还不可能把原始卵泡体外培养至成熟卵母细胞阶段。