子宫颈病变的病毒学

一、关于人疱疹病毒 80 年代以前，有关宫颈癌的病毒学研究多集中在生殖道人疱疹病毒感染，主要包括单纯疱疹病毒 2型（herpes simplex virus 2， HSV-2）和人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus, HCMV） ，分属于疱疹病毒α和β亚科。早在 1968年，Rawls 等就提出 HSV-2 可能是宫颈癌的病毒病因。尤其在有研究报道宫颈癌妇女血中抗 HSV-2 抗体明显增高后，这个概念更被强调。但由于缺乏分子学支持，并且在宫颈肿瘤组织中没有检测到 HSV DNA，80 年代后这个概念被改变了。近期的研究提示 HSV-2 可能在宫颈癌变过程中起辅助作用。血清 HSV-2 阳性增加患宫颈癌的危险，一些学者认为 HSV-2 可能与高危型人乳头状瘤病毒相互影响，增加了有这两种病毒持续感染妇女宫颈癌变的危险性。没有令人信服的血清学证据支持HCMV有病因学作用，仅有很小一部分宫颈癌组织含有 HCMV DNA，而这些 HCMV阳性的宫颈癌患者在组织学和临床生物学行为方面也无特殊性。黄冈市中心医院妇产科陈慧敏

二、关于人乳头状瘤病毒（human papillomavirus, HPV） 1974年，zur Hausen 首次提出 HPV感染与宫颈肿瘤有密切关系。至 1983年，Durst和 Zur Hausen发现了 HPV16。同年，Cuzick 与 Campion 和 Singer 一起开始进行第一个分类研究，即对 100 名宫颈涂片结果为低度病变的妇女进行了 HPV检测，虽然当时所用的检测方法十分落后，但研究结果发现HPV 16感染比 HPV6感染具有更强的使宫颈病变进展的潜能。 随后， Hollingworth等为了更系统地研究这种情况，又使用 Filter 原位杂交技术来检测 HPV，结果却不尽人意。直至 George Terry 等建立了聚合酶链反应（Polymerase chain reaction,PCR）方法，HPV检测的临床意义才被重视。大量的 HPV研究在世界各国进行和完成，人们对HPV感染与宫颈病变的关系的认识日渐统一：HPV感染是宫颈上皮内瘤变及宫颈癌发生的必要因素，无论是实验室抑或流行病学证据均证实了这一观点。

第二节 HPV的类型及致癌机理

一、HPV 基因组结构及其功能 1949 年，Strauss 在电镜下发现了 HPV。HPV 是一种环状双链结构的 DNA 病毒，由 7 800～7 900碱基对组成，没有其他病毒所具有的外膜，是一种没有包被的病毒颗粒。其基因结构含有两个开放读码框 (Open Reading Frames, ORFs) 和 1 个上游调节区(URR)。ORFs 包含 6 个早期转录单位（Early gene region，包括 E1,E2,E3,E4,E5,E6和 E7）及两个晚期转录区（Late gene region， 包括 L1和 L2） 。早期转录区主要对染色体外的 DNA 复制进行调控。其中，E6 和 E7 是病毒癌基因，参与宿主细胞的病毒基因表达和复制，并调控这些活动。E6 和 E7 所编码的蛋白可诱导细胞增殖和转化；它们还参与细胞周期调控：E6与 p53结合、E7与 pRb (retinoblastoma protein, pRb) 结合，导致这两种抑癌基因失活，使细胞无限制生长；此外，E6 还可以激活端粒酶，从而在细胞永生化过程中起着最重要的作用。晚期转录区的 L1 和 L2 则分别编码病毒的主要和次要膜壳蛋白，仅在接近上皮表层的分化细胞中表达。上游调节区不编码蛋白，主要通过 ORFs调节转录和控制病毒蛋白及感染颗粒的产生。

二、HPV 型别和分类到目前为止，已发现和鉴定出超过200种不同类型的 HPV，有 54种可以感染生殖道黏膜。与其他病毒不同，由于 HPV不能在体外培养，对HPV的分类不是基于血清学，而是根据与其他已知 HPV DNA的同源性或重结合动力学，以前通过杂交试验、现在则通过 DNA 测序来确不同的型别。如果测得的某种HPV DNA 序列与已知 HPV的同源性小于 90％，则可被分类为一种新的 HPV类型。不同型别的HPV感染可以导致不同的临床病变。绝大多数HPV对皮肤和黏膜上皮具有特殊的亲嗜性，其中约半数是属于黏膜型的，其余为皮肤型或疣状表皮发育不良型。HPV 的类型很难根据其临床表现划分，因为HPV可以在身体的许多部位的病灶中检测到。 依据 HPV与癌瘤的关系， 感染肛门生殖器的 HPV可分类为低危型（Low-oncogenic risk, LR）和高危型（High-oncogenic risk, HR） ，但对某些不常见的 HPV型别，其致癌危险性尚难以确定。低危型 HPV常常在宫颈良性或低度病变的病灶中检测到，很少存在于高度病变中，如HPV 6、11型与外生殖器和肛周区域的外生型湿关系密切。而高危型 HPV则通常在高度病变中发现，如 HPV 16、18型可在绝大多数宫颈癌和阴道癌中检测到。 表 6-1. HPV 致癌危险性分类分类 HPV 型别低危型 6, 11, 40, 42, 43, 44, 53, 54, 57, 61, 62, 72, 81 (CP8304), 83, CP6108, MM4, MM7, MM8 (P155), MM9 (P238A) 高危型 16, 18, 26, 31, 33, 35, 45, 51, 52,55, 56, 58, 59, 66, 67, 68 (ME180), 82 三、HPV 致癌机理 HPV 感染肛门生殖器和/或口腔黏膜、皮肤的鳞状上皮细胞后，在细胞核中复制。宫颈的癌前病变或癌变多起源于宫颈移行带，主要发生在鳞柱上皮交界处的鳞状化生过程中。而生殖道致瘤性 HPV 往往感染宫颈的移行带上皮。感染发生在移行带的机理可能是由于机械性原因（移行带上皮较薄），也可能是生物性的（上皮贮备细胞可能对 HPV 感染特别敏感）。HPV 以游离状态感染上皮细胞后，可以持续存在于染色体外，不引起任何病变，或引起良性病变和低度病变，如尖锐湿疣或轻度不典型增生等，但癌变则与病毒 DNA 整合入宿主染色体密切相关。高危型 HPV 的 DNA 链通常在 E1 或 E2 的开放读码框内断裂，使 HPV DNA能够整合入染色体脆弱区。E6和 E7则具有促进和维持整合状态的功能。然而，癌变并非绝对需要病毒整合。一些宫颈癌被发现只含有游离状态的 HPV DNA或含有游离和整合的混合状态。如前所述，高危型 HPV(如 HPV16)的 E6 蛋白可与 p53 结合导致 p53 失活，并促进其在细胞内的降解，野生型p53 是一种核蛋白，负向调节细胞的生长和分化，p53 的降解失活阻碍细胞对 DNA 损伤的反应，由此导致遗传性状改变的累积，进而产生恶变的基因型。而E7 蛋白则含有与 pRB的结合部位，pRb是重要的抑癌基因， 直接参与细胞周期的调控。 E7与 Rb亲和力很高，高危型 HPV的 E7蛋白与 pRB结合后导致 pRb 功能失活降解，改变了细胞生长周期的调控机制，使细胞永生化,并且对恶性变的防御进一步受到影响。 然而， 妇女生殖道 HPV的感染率远比宫颈癌的发生率高，说明宿主易感性对 HPV介导的病变发生和发展有影响。如宿主的主要组织相容复合体（major histocompatibility complex,MHC）在免疫识别和抗肿瘤发展方面至关重要，MHC II类基因DQ位点上的等位基因的表达情况与宫颈癌及其癌前期病变的发生有关。此外，抑癌基因 p53 的第 4外显子上第 72 位密码子存在多态性结构，其多态性可能影响宫颈癌的发生。 研究发现， 密码子 72为精氨酸的 p53基因型对 HPV 16 E6蛋白所介导的 p53蛋白的降解更为敏感，密码子 72为脯氨酸的 p53基因型则能抵抗HPV E6 介导的降解， 密码子 72为精氨酸的 p53纯合子妇女发生宫颈癌的危险是密码子 72为脯氨酸的 p53杂合子妇女的 7 倍，但此观点尚存争议。

 第三节 HPV感染引起的免疫反应

HPV通过其嗜表上皮细胞的特性而逃避免疫反应的监控。因此，HPV感染通常不产生强的免疫反应。潜伏感染也不引起免疫反应，因为无伴随炎症。HPV 诱发的免疫反应是型别特异性的，以细胞免疫为主，体液免疫仅占很小一部分。细胞免疫的重要性可以由以下的情况说明：与免疫功能正常者相比，遗传性免疫缺陷患者、医源性免疫功能受损（如淋巴瘤治疗后或肾移植患者）、或艾滋病患者等均有较高的 HPV感染率。对 HPV感染发生作用的是T辅助淋巴细胞，通过一些特异的细胞因子介导，如白介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）和肿瘤坏死因子（TNF-2）。很多 HPV 相关病变能够自动缓解，可能正是细胞免疫的结果。 由B淋巴细胞介导的体液免疫是抗原抗体的反应。L1 和 L2是 HPV表面蛋白的构象抗原，可诱导机体产生对 HPV的中和抗体，也是预防性疫苗接种策略的关键。HPV E6和 E7 蛋白也可诱导产生抗体，但仅在宫颈癌患者发生，CIN患者未发现对 E6/E7的抗原抗体反应。哥伦比亚进行的一项研究发现，82％的宫颈浸润患者和 56％的正常妇女（细胞学检查正常及 HPV DNA阴性）的血清抗 HPV抗体阳性，提示这种抗病毒样颗粒抗体可以作为 HPV目前和既往感染的标志。 第四节 HPV感染的途径和危险因素肛门生殖器官的HPV感染通常是性接触传播的，可以在性伴侣中检出相同的 HPV型别。相反，处女通常是检测不到 HPV 感染的。直接皮肤接触也被认为是主要的传播方式，虽然由非性交途径和通过污染物的传播是很少见的。母亲生殖道的 HPV感染也可以在分娩过程中传播至婴儿的口腔中。尽管多数 HPV感染是亚临床型的，但仍然可以传染播散。 HPV可能通过上皮结构的微创进入上皮基底细胞，并已在细胞膜上鉴定出一种HPV进入的受体分子。

 以下因素与 HPV感染有关：

 1.年龄因素 30岁以后 HPV感染率下降，这可能是由于对 HPV的获得性免疫，也可能是以往妇女较当今妇女暴露于 HPV的可能性较小，因为现在的 HPV感染明显多见。

2.性行为的影响 丈夫阴茎 HPV 的存在可使妻子宫颈受染的危险增加 9 倍。男性性伴侣的数量，以及男性性伴侣本身有多个性伴侣或有HPV感染可增加妇女患 HPV感染的危险性。在只有单一男性性伴侣的妇女中，17％～21％可以在宫颈或外阴检测到 HPV，而有五个以上性伴侣的妇女中，其 HPV感染率高达 69％～83％。第１次性生活的年龄也很重要，首次性交的年龄越小，HPV感染率越高。

 3.男性是否行包皮环切术，也对HPV感染有影响 国际癌症研究机构（IARC）的一项为期 15年的研究表明，行包皮环切术男性的 HPV 感染率明显下降，未环切男性阴茎 HPV 感染率为 19.6％，环切者为 5.5％。而包皮环切者的女性性伴侣发生宫颈癌的危险性明显低于那些未行包皮环切者的性伴侣。

4.避孕方法 使用工具避孕（如避孕套） ，是否减少 HPV感染的危险性尚无一致意见。

5.免疫抑制状态使 HPV感染的危险性增加 如 HIV感染后、肾移植或霍奇金病患者等。

第五节 HPV感染的表现和结局

一、潜伏感染没有明显的临床表现，没有可检测到的病变，上皮细胞形态正常，但可出 HPV DNA。

二、亚临床感染是指肉眼不能发现的病变，但醋酸白试验阳性或在阴道镜下可见异常改变，且有细胞形态学改变。通常无症状。

 三、临床型感染是指肉眼可分辨的病变，可有症状，如下生殖道湿疣和高度病变。大多数 HPV感染是一过性的， 这是 HPV感染最常见的结局， 很少导致临床症状， 也不引起明显病变，即使不治疗也会被机体免疫反应消除，超过 90％的 HPV 阳性者在 4～6 个月内会自动转阴。一旦免疫力消除了某一型 HPV,机体一般不再感染同一型别的 HPV，但并不意味着对其他型别的 HPV 也产生了交叉免疫。非致瘤性（低危型）HPV 的平均感染时间是 8.2 个月，致瘤性（高危型）HPV 的平均感染时间则长达 13.5个月。小部分高危型HPV呈持续性感染，可引起宫颈病变。研究表明，HPV阳性的妇女在两年内发生CIN 1/2者为28％，而 HPV阴性的妇女为 3％。估计约 3％感染 HPV的妇女在她们的一生中会发展为宫颈癌。

 第六节 宫颈 HPV感染的流行病学

一、正常妇女宫颈的 HPV 感染率肛门生殖器的HPV感染主要见于青春期和年轻妇女。生殖器 HPV感染虽然在儿童不常见，但可通过正常的接触，如盆浴时被父母传播。宫颈HPV感染是与年龄相关的，高峰年龄在 15～25岁。文献报道生育年龄（包括宫颈细胞学检查无异常发现）的正常妇女，其宫颈 HPV 感染率在 5％～50％。国外对女大学生的研究发现，约1/3有性行为的女大学生的正常宫颈 HPV DNA阳性。据报道世界范围内，半数以上的性活跃的成年人在他们的一生中至少被一种生殖道HPV感染过。在美国，生殖道 HPV感染是仅次于衣原体和滴虫感染的性传播疾病。美国疾病控制和预防中心估计美国每年大约有 750 000 生殖道 HPV 感染的新病例。国内文献报道正常宫颈HPV感染的阳性率为 11％～37％，且有明显的年龄相关性，与国外文献一致。大于 30岁的妇女 HPV感染率下降。 下降的原因可能是由于对已存在的病毒的免疫清除或抑制以及由于性伴侣相对固定，较少再感染新的病毒的缘故。单一性伴侣的妇女的 HPV 感染率也较低。绝经后妇女 HPV感染明显下降。

二、宫颈病变中的 HPV 检出率及型别分布 HPV DNA 的检出率随宫颈病变的进展而上升。在宫颈上皮内瘤变（CIN Ⅰ～Ⅲ）中，HPV阳性率约为 35％～100％，在宫颈浸润癌中可达 93％～100％。在型别分布上，世界各国的研究报道在宫颈癌中均以 HPV16和 18型为主要类型。最具代表意义的一项研究，是Bosch等于 1995年对 22个国家 32所医院的 1 035例宫颈癌，用 PCR技术进行的HPV检测。其研究结果发现，92.9％的宫颈癌 HPV DNA阳性，且半数以上为HPV 16 感染，其次为 HPV 18及 39、45、59和 68型等。但在中国的某些区域，如上海市和台湾省，HPV 58和 52型被发现是仅次于HPV 16 的类型。在广州市和湖南省，研究发现，HPV 58 和 59是并列第三常见类型，仅次于HPV 16和 18型，且湖南地区的 HPV 58阳性率明显高于广州，但两地区的 HPV 59 感染率无差别。HPV 58是最早从我国江西省宫颈癌组织中发现的一个新型别。一项 14省市自治区的调查显示，HPV 16和58型是宫颈癌组织中主要的类型，北方地区以 HPV 16为主，南方长江中下游 HPV 58 明显增多,江西省 HPV 16型与 HPV 58型的检出率基本相似。

第七节 HPV感染的检测方法

由于 HPV 不能在体外细胞培养，且不能诱导易于检测的免疫反应，故无法用简便的血清学检测进行 HPV的诊断和分型。临床上可从以下几个方面诊断 HPV感染。

1.直视或辅助方法观察 HPV 感染的特征性临床表现 如呈乳头状或细指状生长的尖锐湿疣，有时表现为宫颈红斑或白斑的宫颈上皮内瘤变等。但 HPV 感染缺乏特异性症状，且多数为亚临床感染，故少于四分之一的生殖道 HPV 感染能被肉眼诊断。醋酸试验和阴道镜检查有助于鉴别可疑的病灶，特别是亚临床病灶。

2.应用显微技术对 HPV 感染引起的细胞学和组织学变化进行诊断 其特征性病理改变是空泡细胞，以及不同程度的上皮内瘤变。

3.应用各种分子技术检测HPV病毒基因组,包括原位杂交、斑点杂交、核酸印迹、杂交捕获法（Hybrid Capture 2, HC2）和 PCR等 其中以 PCR方法的敏感性最高，在科研中应用最多。HC2的原理是利用化学发光对抗体捕获的信号加以放大，可检测 13 种常见的高危型 HPV 的全长 DNA，检测高度病变的敏感性达 88％～100％，阴性预测值高达99％，且有高度的重复性，实验室要求简单。2003年 4月，美国 FDA 批准对 30 岁以上妇女使用 HC2 联合宫颈细胞学检查作为宫颈癌的普查初筛方法。目前，HC2 是唯一获美国 FDA 认证的、最好的临床 HPV诊断方法。

 第八节 HPV检测的临床意义

一、用于宫颈癌的筛查 50 多年来，宫颈巴氏涂片在西方发达国家的广泛应用，已使宫颈癌在这些国家的发病率下降了 70％～80％。但这种筛查方法耗资巨大，且有一定的局限性，如敏感性欠佳，尤其对宫颈腺癌的检出率低；可重复性差，受阅片者的主观性影响；阳性预测值低等。而 HPV 的检测是客观指标，敏感性高，近年来已被逐渐用于宫颈癌的筛查。2001年9月，欧洲妇产科传染病协会将 HPV的检测列为子宫颈癌的普查项目，与宫颈涂片结合、或作为宫颈涂片的替代项目进行宫颈癌普查，目前正在进行大规模研究来评估这一方法。美国癌症协会于 2002 年 4 月推出的临床实践指南中，也将 HPV 检测与宫颈巴氏涂片相结合用于 30 岁以上的妇女的筛查，对两种检查均阴性的妇女，每 3 年复查 1 次；若巴氏涂片阴性，HPV 阳性者，则 1年复查 1次。

二、用于细胞学检查有轻微异常的再分类对常规宫颈细胞学检查诊断为意义未明的不典型鳞状细胞(ASCUS)或不典型腺细胞(AGUS)，以及低度宫颈上皮内瘤变(CINⅠ)者，可以利用HPV检测筛选出高危病例。虽然经细胞学诊断的 ASCUS或 CIN 1患者中，仅5％～20％ 经活检证实为CIN，且 CINⅠ可以自然转归为正常上皮，但如果 HPV检测为高危型，则应进行阴道镜检查，必要时镜下活检；如果 HPV 阴性，可于 1 年后重复细胞学检查。有研究发现，HPV阳性的妇女在随访中诊断为CINⅠ的可能性是初始 HPV阴性妇女的 3.8倍，发展为 CINⅡ/Ⅲ的可能性是 HPV阴性妇女的 12.7倍。

三、用于宫颈病变治疗后的随访 CIN 治疗后约 10％复发，HPV检测对诊断复发具有更高的敏感性，而特异性与细胞学相似。最佳复查时间还需进一步研究。有研究表明，CINⅢ病例治疗后，HPV阴性者无病灶残留或复发，而 HPV阳性者，复发危险明显增加。因此，如果治疗后复查宫颈涂片和 HPV 检测均阴性者，应回到常规普查中；如果 HPV阳性，则应再次阴道镜检查。此外，HPV 的检测可能对宫颈癌的预后有预测作用。有研究指出 HPV DNA 检测阴性的宫颈癌，其累计无瘤生存率为100％，HPV DNA阳性者仅 56％。HPV是否阳性及 HPV型别还与宫颈癌盆腔淋巴结转移相关。Rose 等发现 HPV 18阳性可能是宫颈癌术后复发的高危因素。

 第九节 HPV感染的处理

一、目前的策略 “治病不治毒”是对 HPV感染的处理原则，即仅治疗 HPV感染引起的病变，而不是治疗 HPV感染本身。对生殖道 HPV 病变，主要的治疗方法包括物理消融（如激光、冷冻） 、细胞毒药物（如鬼臼树脂） 、光动力学治疗及免疫制剂（如干扰素）等。然而，这些方法都不能彻底清除病毒，未来的发展方向是疫苗和抗病毒药物的开发。

二、HPV 疫苗尽管 HPV的检测及预防浸润性病变十分重要，但最终目标是通过接种疫苗根除高危型 HPV感染， 使宫颈癌的一级预防成为现实。疫苗接种可使筛查年龄推迟，可能节省费用。然而，随着疫苗的商品化，一些新的问题可能会出现：疫苗应用可能对宫颈涂片筛查计划产生负面影响，应当积极进行公共卫生教育减少这种影响；应当建立对有高危型 HPV 感染的妇女进行疫苗接种的建议或指南。HPV DNA 检测可以发现很多妇女有高危 HPV 感染，预防接种是否也应包括这些妇女？需要研究感染后的接种是否影响感染的进程，也许预防接种甚至会降低自身免疫的效应；昂贵的费用和有限的疫苗生产能力可能影响 HPV 疫苗在发展中国家的使用，需要努力克服这些障碍。

 1.预防性疫苗 用于预防 HPV感染。包括病毒外壳蛋白疫苗、合成多肽疫苗和核酸疫苗。研究表明， HPV L1具有自我装配成病毒样颗粒的特性，这种病毒样颗粒能刺激机体产生中和抗体而预防HPV感染。外壳蛋白自我组装的病毒样颗粒有良好的抗原性和免疫源性，但没有病毒DNA存在，不会在体内引发感染和癌变等，且对热稳定，小剂量即可引起持久的免疫力，因此，表达 L1结构蛋白的病毒外壳蛋白疫苗是目前预防性疫苗中最有应用前景者。而核酸疫苗可同时激活体液免疫和细胞免疫，可在一个质粒上同时多个同型或异型的 L1 基因，成为高效、多价的 HPV预防性疫苗。且由于抗原是质粒，提纯比蛋白简单易行，但核酸疫苗是“活”疫苗，其安全性值得关注。目前，Merck、GlaxoSmithKline 公司和美国国立癌症研究所（NCI）研制的 HPV L1 疫苗正在进行 III期临床试验，以评价疫苗对型别特异性HPV持续感染的保护作用，预计将在未来两年内获得初步分析报告。法国的早期研究结果表明，三价（HPV 11，16，18）病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs）疫苗能够很好地被耐受和产生抗HPV的中和抗体，且持续 2.5年。另一项在 2 392名妇女中进行的对照研究发现， 使用 HPV 16 L1 疫苗的妇女无1例发生 HPV16 持续感染， 而安慰剂组则有 3.8％发生 HPV持续感染。 对另一种基于 HPV L2的多肽预防疫苗也进行了一项临床试验。与 VLPs不同的是，L2抗原可以诱导交叉反应的中和抗体，但目前 L2 诱导的中和抗体滴度不够高，且其所诱导交叉反应的相关 HPV型别的范围有待进一步确定。

 2.治疗性疫苗 用于抑制 HPV 引起的相关肿瘤。包括重组蛋白疫苗、多肽疫苗、嵌合疫苗和核酸疫苗。其基础是用 HPV的 E6和 E7蛋白激发机体抗肿瘤的细胞病毒性淋巴细胞反应，通过细胞免疫消除已存在的 HPV感染和抑制与 HPV相关癌前病变和癌的进展。国外已开始用于治疗晚期宫颈癌病人， 虽然都能在体内产生抗疫苗的IgG抗体，部分病例还产生了 HPV特异性的细胞毒性淋巴细胞反应，但尚未达到理想的肿瘤缩小的效果。三、抗病毒治疗理想的抗病毒药物应当既可以治疗潜伏感染，也可以控制临床型病变。尤其对那些免疫抑制的患者，体内常有多个HPV感染引起的病灶， 抗病毒治疗是最适宜的。 诱导凋亡可能是一些抗病毒药物(如Acitretin 和 Cidofovir)的作用机理，鉴别和干扰 HPV 病毒蛋白和宿主蛋白的相互作用是研究的关键。已有研究表明，在瘤变细胞内消除 HPV E6的功能是可行的，但研制这种抗病毒药物尚有很多问题有待解决。