妇产科在线APP下载
【关键词】 聚合酶链反应；反相斑点杂交；解脲脲原体
生殖道感染在全球是一个重大的公共卫生和社会问题，其广泛流行已对广大的男性、女性和儿童造成了严重的医学和心理损害，已经受到人们的广泛重视。目前解脲脲原体(uu)已成为盆腔及生殖器炎症的主要病原体。然而，女性下生殖道内查到uu者，是否皆须按非淋菌性阴道炎进行诊治，近年来一直困扰广大妇产科医生。有学者研究认为uu的感染与其群别和亚型的型别相关¨ J。目前临床中尚未有一种简单易行的进行uu分型的方法。本文就这方面的研究报道如下。
1 资料与方法
1．1 研究对象选择2003年11月至2005年11月在中山大学附属第二医院门诊就诊的有外阴阴道炎
症状和体征的患者，601例，年龄l7～50岁[(29．9 4-6．4)岁]，要求2周内未行药物治疗。对照组为健康体检的人群，年龄l7～50岁[(30．7 4-6．3)岁]，共306例，为同期正常体检人群，无自觉症状，妇科检查无阴道炎阳性体征。
1．2 研究方法全部病例详细登记自觉症状及体征，按常规方法用棉拭子取宫颈管分泌物。标本按荧
光定量PCR(FQ—PCR)的要求及操作进行标本的处理和定量检测。判断结果是其图形为标准的S形状且目的DNA≥1．00×10。拷贝／ l为阳性 。
1．2．1 反相斑点杂交的检测(Reverse dot blot，RDB)
1．2．1．1 引物、探针的设计与合成 (1)引物设计：从美国国立生物信息中心(NCBI)[网址http：／／W＇WW．ncbi．nlm．nih．gov／]查出解脲脲原体者各型别的DNA序列，利用解脲脲原体各标准菌株MB抗原基因间的序列差异，用oligo 6．0软件进行LLX~，设计了2套通用引物，可以扩增解脲脲原体14个基因型。MF：5 一GTATIT1、GCAATC I’ITATATGTITrCTGT-3 (7-
35 28 bp)；MR 5 一CTGATGTAAGTGCAGCATI＇AAATTC-3 (209 235 26 bp)。(2)探针设计：网上选出解脲脲原体各基因型的特异性探针，根据文献资料，分级设计了5条探针，用于选择性扩增 parvum(微小脲原体)中1、3、6和14基因型和 urealyticum群。M1 P1：5 TI＇ACACATATI＇AAATAAAGACAATAAAAT-3 ：M3P1：5 一TATCTAAGA ITACCAAATCTI＇AGTGTT一3 ；M6P1：5 -TAT1Trm ’^CTAGTATI＇AAATI＇AAAAACAAT
一3 ：M14P1：5 一ACTGTAGAAATI＇ATGTAAGATTAATAAA-3 ： MXP1： 5 -TATATITI℃CAAAACTATAAATAGACACA．
3 。合成后用去离子水稀释至浓度
15 pmol／L，分装后一2O℃保存。
1．2．1．2 杂交膜条的制备 (1)膜条格式设计：把膜条设计成9孔备用。(2)打印膜条。(3)洗膜：称取1 g EDC，溶于1O ml蒸馏水中(10％EDC溶液)，倒进盛有膜条的盘子中，摇动，使每张膜能充分接触EDC，用时30 min。然后用蒸馏水冲洗3次，最后铺在滤纸或吸水纸上晾干。(4)探针稀释：每个探针5端标记了NH 基团，纯化后用超纯水把探针稀释成10 pmol／l~l的母液，点膜时把母液再稀释成15pmol／l~l。(5)点膜：把稀释好的探针点到膜条相应的格子中，每个点0．8 ILl。(6)膜条的处理：点好探针的膜条在室温放置15 min，然后把膜条浸泡在0．1％氢氧化钠中摇动5 min，倒去氢氧化钠，用蒸馏水冲洗3次，最后铺在滤纸或者吸水纸上晾干，保存于4 ℃ 。
1．2．1．3 反相斑点杂交的步骤 (1)应用MBI反应体系(Taq酶2 l，在NTP 1 txl，MF 1 txl，MR 1 txl，5×bu艉r 1O txl，DNA 5 txl，超纯水补足5O 1)，标本DNA5 l PE 9600反应仪进行DNA扩增。(2)PE9600反应条件为：93℃预变性2 min；然后93℃ 30 S，55 oC40 S，72℃ 40 S，共4O个循环；最后72℃保温7 min。(3)电泳检测：取PCR产物8 加6 x bufer 0．5于2％晾脂糖凝胶电泳20 min，条件为电压150 V，电流75 mA，英国UVP公司生产的GDS 7600凝胶扫描
系统鉴定。(4)按以下步骤在凯普快速杂交仪上进行杂交：①预热约5O ml的杂交液I和5O ml的杂交
液II，置于46℃水浴预热。②镊取RDB膜条并编号。取数个1．5 ml离心管并编号(与膜条号对应)，
加入0．5 ml预热的杂交液I。③膜条置于杂交仪上的杂交糟中，设定操作温度46℃，取预热的杂交液I1 ml加入槽中，进行预杂交，开泵抽干液体。③将扩增产物98℃ 、10 min变性，冰浴2 min以上，再将扩增产物加入步骤2的离心管中混和，然后全部加入杂交槽中，静置10 min，开泵抽干液体。⑤取预热的杂交液II 1 ml加入杂交槽中清洗膜条，开泵抽干液体，重复3次。⑥设定操作温度25℃，取溶液I 1 ml加入杂交槽中，静置2～3 min，，开泵抽干。⑦取室温杂交液I 1 ml加入杂交槽中清洗膜条，重复3次。⑧取溶液II 1 ml加入杂交槽中，静置片刻，开泵抽干。⑨取显色液1 ml加入杂交槽中，避光10 min，开盖观察结果。阳性结果为在显色时间内出现清晰可见的蓝色圆点，无色或极淡的显色均为阴性结果。
1．2．2 DNA测序鉴定随机抽取18份实验中检测出uu基因型的样品进行DNA测序，以证实RDB检
测方法的正确性。DNA测序采用Sanger双脱氧链末端终止法，由博亚生物工程技术公司完成。
1．3 设备ABI 7000荧光定量PCR仪，美国PerkinElmer公司产品；万分之一分析天平ChyoJKII80；VQPCR试剂盒由中山大学达安基因诊断中心生产。
1．4 统计学方法采用SPSS 11．5的 检验。
2 结果
2．1 2组病例FQ．PCR检测病例组解脲脲原体阳性421例占70．O％ (其中261例为单独阳性，占
62．O％)，对照组解脲脲原体阳性126例占41．2％(其中110例为单独阳性，占87．3％)。对单纯解脲脲原体检测阳性的371例进行了基因型鉴定。
2．2 解脲脲原体分型
2．2．1 解脲脲原体基因型的总检出 2组人群解脲脲原体基因型的检出率差异无显著性，总检出率为81．9％2．2．2 解脲脲原体分群情况病例组和对照组均以U．parvum群为主(分别为65．4％及79．3％)，且对照组检出率较病例组高，差异有显著性(P<0．05)。
urealyticum群的检出率2组差异无显著性。而病例组中解脲脲原体2群感染率较对照组高，差异有显著性(P<0．05)。
2．2．3 2组人群 parvum群(微小脲原体)的单型别分布情况对照组中 parvum群1型的单型别感
染较病例组高(P=0．000)，U．parvum群3、6、14型单型别感染在2组差异无显著性。
此外， urealyticum群与1型的多型别感染在病例组较对照组高( =6．728，P=0．009)。在多型别感染中1型的检出率病例组较对照组高( =4．936，P=0．026)，其余多型别感染2组差异无显著性。而在U．parvum群中的1、3、6型的单型别为主(57／69=82．6％ )。
2．2．4 病例组不同年龄段解脲脲原体的分群情况结果表明，病例组不同年龄段解脲脲原体的分群差异无显著性。
2．3 临床阳性标本的DNA序列测定18例用RDB检测的阳性样品的测序结果均为相应的解脲脲原体
基因型。
3 讨论
3．1 女性下生殖道解脲脲原体基因型检测及其意义
研究表明，无症状的性成熟女性，泌尿生殖道解脲脲原体离率为56．8％[41，并可受到年龄、性生活、避孕方法及性激素水平等因素的影响。部分可致泌尿生殖道炎症，这虽可能和宿主易感性有关，也可能是某个群与疾病相关，而且可能只有某些基因型具有致病性¨．z J，然而到底哪些基因型具有致病性尚未完全清楚。探讨不同人群中解脲脲原体基因型分布，将有助于对解脲脲原体在女性泌尿生殖道感染机制的进一步认识。
目前国内常用的方法为限制性片段长度多态性分析(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) J，应用Hinf I内切酶内切PCR扩增产物，根据不同的内切位点所得片段的大小分型‘6 J，但两者也受到一定的限制。
我们采用反相斑点杂交 对FQ—PCR检测为单纯解脲脲原体阳性的371例进行了基因型鉴定。其
中女性下生殖道感染患者261例和正常体检人群110例。本研究首次采用反相斑点杂交将 parvum
群(微小脲原体)所有4个基因型明确区别开，对urealyticum群亦能同时检测。本试验所采用的以
PCR为基础的反相斑点杂交方法虽然有假阴性的问题，但敏感度高达81．9％，阳性预测价值为100％ 。通过PCR扩增，反相斑点杂交可以同时检测15个标本，从DNA提取到反相斑点杂交试验结果报告，整个试验过程在2天内完成，相比传统代谢抑制方法可以缩短实验室周转时间，及时为临床制定治疗方法提供依据。因此，反相斑点杂交能进行解脲脲原体基因分型，方法简单、实用，有望发展成为用于临床标本的解脲脲原体分型的一种方法。
3．2 女性下生殖道解
