摘要:体外授精 胚胎移植(IVF ET)技术发展至今,如何提高较低的成功率始终困扰着生殖医学工作者。囊胚期胚胎培养与移植技术是最近发展起来的新技术,建立囊胚培养系统,提高了胚胎的着床率与临床妊娠率,为开展植入前遗传学诊断创造条件,具有十分重要的应用前景。
     关键词:囊胚;体外培养;体外授精 胚胎移植
1978年试管婴儿的出生为人类生殖自我调控开创了新纪元。20多年来,随着促排药物的广泛使用。体外培养系统的逐步改善和显微操作技术的革新应用,辅助生殖技(assisted reproductive 
technology,ART)取得了长足的发展。分裂期胚胎的临床妊娠率一般在30％左右,近年发展的囊胚培养技术已被证明可使胚胎种植率大大提高,较多的文献数据也支持囊胚期胚胎移植可提高临床妊娠率。同时可通过只移植最好的胚胎来限制移植胚胎的数量,以达到减少多胎发生的目的。囊胚培养与移植是当前助孕技术的研究热点,本文就囊胚培养与囊胚移植的研究进展作一综述。
     1 囊胚培养条件 
　　胚胎体外培养从单一培养。共同培养发展到今天的序贯培养。体外培养的不同时期,胚胎对培养液的成分有不同的要求,使用单一培养液显然是不够的。共同培养系统较后来发展起来的序贯培养系统复杂,且共同培养可能产生对胚胎的污染,近年已逐渐被专为囊胚培养设计的序贯培养系统替代[1]。序贯培养注意到体外培养的胚胎在不同发育时期代谢需求的不同,配制出同系列。不同成分的培养液,依次采用适合该时期营养需要的培养液进行培养。Gardner配制了G1。G2序贯培养液。G1含有与输卵管液相同的碳水化合物以及早期分裂期胚胎必需的非必需氨基酸。谷氨酰胺。EDTA,用于配子至8细胞期的体外培养。G2与G1的主要区别是去除了抑制内细胞团发育和囊胚形成的EDTA成分,碳水化合物含量与子宫相同,同时含有必需与非必需氨基酸,从而用于8细胞期至囊胚的培养[2,3]。8细胞期以后,随着细胞的生长及分化,需要碳水化合物。核酸。维生素等成分[4]。尽管人胚胎发育过程中所需的确切氨基酸尚不清楚,但已发现加入必需和非必需氨基酸后可使囊胚形成率明显升高[5]。   关于胚胎发育过程中无机磷的作用尚不清楚。最近的研究发现,一些生长因子在囊胚形成过程中起着积极的作用,例如肝素结合的表皮生长因子(heparin binding epidermal
 growthfactor)能增加优质囊胚的数量[6]。G1。G2是目前最常用的序贯培养液,其他常用的商品化序贯培养液还有S1。S2,Q1。Q2。Q3,P1。P2等系列培养液。
      对低氧环境培养系统是否影响囊胚形成仍存在争议[7,8]。有作者认为5％CO2。5％O2。90％N2的培养系统降低了氧浓度,低氧环境使氧自由基产物减少,并可破坏或结合培养基中的某些毒素。空气纯净化是实验室的重要环节,空气中一些有害气体可影响体外培养的胚胎生长,已证实净化空气可以提高IVF的成功率。
     2 囊胚质量评价系统
     体外培养条件的改善,延长了胚胎体外培养的时间。通常情况下,囊胚指受精96~120h后的发育期胚胎。早期囊胚可见于受精后的第4d或第5d,晚期囊胚可见于受精后的第5d或第6d。囊胚由120~150个细胞组成,包括囊胚腔。内细胞团(inner cell mass,ICM)和滋养层细胞(trophoectoderm)。内细胞团将发育成为胎儿,滋养层将发育成为胎盘的一部分。各IVF中心报道的囊胚形成率集中在45％左右[9]。Hsieh等[10]对201个周期的胚胎进行无血清序贯培养,总的囊胚形成率为49.4％。
      囊胚的质量通常是通过镜下的形态学观察进行评定的,主观性较强,迫切需要一个统一的量化指标对囊胚质量进行分级界定。目前常用的分级标准有2种。一种是Dokras等[11]提出的较简便的分级标准,将囊胚分为3级。1级:第5d或第6d形成具有清晰的滋养层细胞和内细胞团的扩展囊胚;2级:比1级囊胚发育延迟24~48h,第6d或第7d形成与1级形态相似的囊胚;3级:体外培养5~7d形成的内细胞团与滋养层细胞内有一些退化区域并且囊腔发育差的囊胚。
     另一种分级标准为人类囊胚分级系统(scoring system for human blastocysts),其观察指标更为详尽。根据囊胚腔的大小和是否孵化,将囊胚的发育分为六个时期。1期:早期有腔室囊胚,囊胚腔小于胚胎总体积的1/2;2期:囊胚腔体积大于或等于胚胎总体积的1/2;3期:完全扩张囊胚,囊胚腔完全占据了胚胎的总体积;4期:扩张囊胚,囊胚腔完全充满胚胎,胚胎总体积变大,透明带变薄;5期:正在孵出的囊胚,囊胚的一部分从透明带中逸出;6期:孵出的囊胚,囊胚全部从透明带中逸出。处于3至6期的囊胚,还需对其内细胞团和滋养层细胞进行质量分级。内细胞团分级:A级,细胞数目多,排列紧密;B级,细胞数目少,排列松散;C级,细胞数目很少。滋养层细胞分级:A级,上皮细胞层由较多的细胞组成,结构致密;B级,上皮细胞层由不多的细胞组成,结构松散;C级,上皮细胞层由稀疏的细胞组成。根据这个分级方法,第5d最好的囊胚评分应该是4AA。
      人类囊胚分级系统与Dokras的分级标准相比,细化了观察指标,根据囊胚发育阶段。内细胞团和滋养层细胞的综合情况评定囊胚质量,分级更细,评定更全面。通过对囊胚的发育和质量的评价,为挑选移植胚胎及评估胚胎着床率及妊娠率提供了依据。
     3 囊胚移植的着床率、妊娠率与多胎率
     囊胚移植的着床率与妊娠率是评价囊胚移植成功与否的重要指标。Marek通过对790个周期的受精后第3d(D3)分裂期胚胎移植与受精后第5d(D5)囊胚移植的比较发现,着床率分别为23.3％和32.4％,妊娠率分别为35.9％和43.8％,均有统计学差异,提示通过延长体外培养时间,能显著提高胚胎的着床与妊娠能力[12]。影响囊胚着床及后续妊娠的因素很多,故各IVF中心报道的着床率和妊娠率也有很大差异,但囊胚发育程度影响移植结局的观点比较一致。移植至少1个1级或2级囊胚或早期孵化囊胚将提高着床与妊娠比例[13]。扩张期囊胚的妊娠率高于非扩张期囊胚[14]。女方年龄超过40岁,囊胚移植的成功率明显下降[15]。在囊胚移植中卵的质量。辅助孵化技术的应用价值等尚无定论。 
      囊胚移植较分裂期胚胎移植的着床率。临床妊娠率高,从而在保持相同甚至更高妊娠率的前提下,通过减少移植胚胎的数目减少多胎妊娠[16]。移植囊胚的数目以2个为宜,因为移植2个囊胚期胚胎的妊娠率与3个是相似的,并可使多胎率下降[17]。关于囊胚培养与移植是否增加单卵双胎的发生尚存争议[18]。
      4 囊胚期胚胎移植的优点
     延长胚胎体外培养时间具有许多优越性。胚胎能否发育至囊胚与其自身的基因有关。体外培养发现,4~8细胞期的胚胎发育存在阻滞现象,当胚胎没有发育潜能或携带有异常的染色体和基因时,在培养至囊胚期的过程中可因自身发育异常被自然筛选掉,只有质量最好的胚胎才能发育至囊胚期[19]。体外培养时,胚胎逾越8细胞期的发育阻滞而成为获得生命力的胚胎。
      经筛选发育至囊胚的胚胎通常质量较好。通过移植囊胚期胚胎而非卵裂早期胚胎,提供更接近生殖生理的自然环境,使胚胎发育与子宫内膜同步化,具有较高的种植能力。囊胚移植入子宫腔后缩短了胚胎进一步发育与着床之间的间隔,也减少了母胎相互间某些不利因素的影响。囊胚质量评价系统的出现,为挑选高质量胚胎提供了量化指标。在提高种植率的基础上,减少移植的胚胎数,为降低多胎妊娠率创造了条件。
      囊胚培养为分裂期胚胎活检,进行植入前遗传学诊断(PGD)提供了充足的时间。囊胚期可对滋养层细胞进行活检,提供了较多的细胞来源,活检滋养层细胞而不影响胚胎发育,避免了活检对胚胎继续发育的影响[20]。囊胚培养还为人类胚胎干细胞研究提供了细胞来源。
　　总之,囊胚培养已被公认是一种提高胚胎种植率与妊娠率,减少多胎妊娠的方法。国外许多IVF中心已将此作为常规技术进行应用,国内近年来也有少数实验室开展了这项研究,并于今年3月在湖南诞生了第1例通过囊胚移植获临床妊娠且成功分娩的试管婴儿。囊胚培养中,当分裂期胚胎数目少或质量差时,需告诉病人继续培养可能发生因囊胚培养失败而放弃移植的后果[21]。随着基础理论的突破和操作技术的革新,在冷冻后复苏胚胎。活检后胚胎的体外培养,种植前辅助孵出及基因诊断技术方面将获得长足的发展。