一、循环肿瘤DNA


早在1948年，Mandel 和 Métais就在人类的血液中发现了独立于细胞之外的游离DNA（Cell-free DNA, cfDNA）[2]。1977年，S. A. Leon等通过放射免疫分析的方法，发现了血清cfDNA水平与肿瘤的相关性。他们以125I标记DNA，检测血清中的cfDNA，分别观察173例不同肿瘤患者和55例健康对照后发现，肿瘤患者体内cfDNA水平显著升高；而接受放射治疗后，部分患者体内cfDNA水平显著降低，其水平与肿瘤大小、患者疼痛指数有相关性[3]。该研究为此后ctDNA（Circulating tumor DNA）与肿瘤之间相关研究奠定了基石。


循环肿瘤DNA（Circulatingtumor DNA, ctDNA）定义为循环血液中所存在的肿瘤DNA片段。与cfDNA不同，ctDNA强调与肿瘤的相关性，即它来自肿瘤，且片段中含有肿瘤特异性的突变。健康人血液中存在cfDNA，但是一定没有ctDNA；恶性肿瘤患者cfDNA载量明显上升，其中大部分均为来自肿瘤释放的ctDNA。其次二者检测手段不同，cfDNA可以以一段稳定的体细胞序列为探针，但ctDNA检测必须运用肿瘤特异性突变做探针。限于目前对肿瘤基因组的认识不足，因此许多研究中使用cfDNA的水平替代ctDNA来检测恶性肿瘤。


肿瘤患者血液中的循环DNA带有肿瘤相关的基因和表观基因型突变，这些突变与肿瘤的发生、进展和耐药性相关。突变类型包括杂合性缺失（loss of heterozygosity,LOH）、抑癌基因突变（如tp53基因）及原癌基因突变（如kras和braf基因）。其中kras基因突变见于10%-30%的子宫内膜癌患者[4]。p53基因突变也常见于子宫内膜癌中，甚至与患者的预后有一定相关性[5]。此外子宫内膜癌中常伴有表观遗传学的改变，如甲基化异常。这些突变位点作为检测靶点，是ctDNA检测的基础。cfDNA由基因组DNA（genomic DNA）和线粒体DNA（mitochondrialDNA）构成。同样包含编码DNA和非编码DNA，其中非编码DNA可以用来检测微卫星不稳定、杂合性缺失（LOH）、基因多态性、完整性等异常改变[6]。


循环DNA的产生机制不甚明确，目前有许多假说与猜测。研究者推测血液中游离的核酸来自坏死和凋亡的肿瘤细胞。此外，ctDNA也可能来自于癌细胞的主动分泌。正常机体中坏死和凋亡的肿瘤细胞通常会被巨噬细胞和其他细胞吞噬清除，巨噬细胞吞噬坏死和凋亡的癌细胞后，将断裂的DNA释放入附近的组织环境，进入血液形成ctDNA[7]。这一释放过程可能是主动转运。据估计若肿瘤组织超过100g（约3*1010个细胞），则每天将会有约3.3%的肿瘤DNA释放入血[8]。DNA碎片的大小介于70-200个碱基对不等，大者可达21kb。循环中肿瘤细胞（circulating tumor cells，CTCs）或已转移至远处的转移细胞也可能是ctDNA的来源之一。


肿瘤具有异质性，一块肿瘤组织所含细胞的基因组不尽相同，且其内包括部分正常的间质细胞。肿瘤进展过程中，肿瘤相关性的ctDNA和野生型（正常）cfDNA同时会被释放入血，因此尽管来源于同一块肿瘤组织的cfDNA其成分也千差万别。cfDNA的血清水平同样受到清除率、降解率和其他血液系统、淋巴系统的滤过影响。核酸通过肝脏和肾脏代谢，其半衰期在15分钟-7小时之间[9]。值得注意的是，血清中ctDNA载量上升可见于多种状况，除恶性肿瘤之外，良性肿瘤、炎症、中风、创伤、脓毒血症等应激状况下也会上升，在进行检测时应注意鉴别。


二、ctDNA检测与液体活检


“液体活检”（Liquid biopsy）指通过采集患者体液，包括血液及唾液、汗液等分泌物，进行无创的肿瘤检测的方法。目前常见的检测项目包括循环肿瘤细胞（Circulating tumor cell, CTCs）、循环肿瘤DNA、循环肿瘤mRNA及肿瘤细胞来源的外泌体（tumor cell-drived exosomes,TEXs）等[10]。它们共同的特点是需要经过采集体液、富集、通过特异性探针捕获细胞/DNA/mRNA/外泌体、定量检测的过程。


ctDNA的检测目前缺乏一个标准的手段，目前最常见的检测方法为聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR），具体又分为实时定量PCR、数字PCR等方法。但是整个检测流程，包括采血、处理、标本储存、制定正常值等问题都亟待规范。因为血中ctDNA的片段极小，DNA的富集是目前最复杂的问题。另一个需要规范的是检测平台与计量单位。目前ctDNA检测尚处试验探索阶段，不同研究应用不同的平台和方法，为试验结果的解读和比较带来了困难。


三、ctDNA与子宫内膜癌


理论上ctDNA检测是一项精准技术，具有良好的发展前景，但囿于目前肿瘤基因组的认识不足以及检测手段的局限性，同样关于子宫内膜癌的研究结果亦不尽人意。


Tanaka等[11]比较了子宫内膜癌患者与良性疾病及健康对照的血清cfDNA水平差异。共纳入53例子宫内膜癌患者，9例良性妇科疾病患者和15例健康对照进行试验。检测技术使用实时PCR的方法，检测位点为Alu序列。术前一天采集外周血，4℃下3000转离心20分钟并储存-80℃环境中。结果表明子宫内膜癌患者cfDNA定量略高于良性病变患者，但是无统计学意义（P=0.095）；患者术前和术后相比较，cfDNA水平差别也不具有统计学意义。该研究表明ctDNA定量在子宫内膜癌筛查中的应用具有局限性，作者推测同一患者不同时间点cfDNA水平的变化可能具有意义。


Dobrzycka等[12]进行了一项研究，旨在评估cfDNA作为血清标志物的敏感性与特异性。他们共纳入了109例初诊子宫内膜癌患者，应用限制性片段长度多态性PCR（Polymerase Chain Reaction-RestrictionFragment Length Polymorphism, PCR-RFLP）检测kras基因的12个突变位点。结果20例（18%）患者血中检出cfDNA，其中II型内膜癌患者检出率较高，可达36.4%（8/22）；而I型内膜癌中检出率仅为13.8%（12/87）。作者因此认为cfDNA有作为II型子宫内膜癌独立血清预后因子的潜力，其联合p53-Ab诊断子宫内膜癌甚至指导治疗。该研究中cfDNA的检出率并不高，可能仅以kras基因突变作为检测位点有关，若增加其他位点可能会提高一定的检出率。


Pereira等[13]对子宫内膜癌和卵巢癌患者血清中的ctDNA进行较为全面的研究。研究小组共纳入卵巢癌22例，子宫内膜癌17例，选择微精式数字PCR（Dropletdigital PCR,ddPCR）系统和全基因组测序的技术分离ctDNA。对部分患者肿瘤标本进行全基因组测序，筛选出目标基因，再运用PCR的方法分离血清ctDNA。另一部分患者则针对50种常见的癌基因/抑癌基因突变进行检测，共覆盖21820个突变位点。结果提示，ctDNA对于子宫内膜癌和卵巢癌诊断的敏感性与CA125相似，但是特异性非常高，因此在特异性方面优于CA125。对比手术前后ctDNA的水平，研究者观察到术后ctDNA的消失与患者预后（OS与PFS）显著相关。10例有随访数据的患者中，4例患者术后平均ctDNA水平＞10拷贝/ml，最后均因疾病而死亡；5例患者术后ctDNA测不到，截至试验结束均生存，且其中2例已生存5年以上。但作者同时提出，术前ctDNA水平与患者生存无关。这项研究最大的优势是使用了全基因组测序的方法，个体化筛选患者的突变基因，因此ctDNA的检出率非常高。研究结果提示，该类精准ctDNA检测能够预测患者预后，可作为术后随访监测指标，指导早期发现复发与转移。


综合以上文献，目前认为循环肿瘤DNA的检测并不适用于子宫内膜癌的早期筛查。值得一提的是，Dobrzycka等的研究提示我们ctDNA可能对II型子宫内膜癌敏感性更强。这类特殊类型的子宫内膜癌，如浆液性癌，其侵袭转移能力强，早期即可发生盆腹腔转移，若能通过ctDNA筛查，则临床意义更大。子宫内膜癌患者血清中同样存在有异常甲基化DNA片段，可以作为检测靶点，甲基化的异常在其他妇科肿瘤中均有研究，但是子宫内膜癌相关研究甚少。究其原因，一方面由于子宫内膜癌早期症状明确，健康人群无需进行常规筛查；另一方面通过宫腔灌洗液或子宫内膜活检的方法可以简单、方便的获得细胞学标本，对组织学标本DNA检测较血清或血浆更为精确[14]。


四、展望


ctDNA检测仅通过采集患者外周血，即可获得体内肿瘤细胞的基因组信息，是一种突破性的革新技术。相较于传统的内膜活检具有以下独到的优势：①无创，避免了传统方法为患者带来的不适；②取样全面，一次性采集体内肿瘤细胞的全部信息，避免肿瘤异质性带来的取样不全；③精准，直接获得肿瘤基因组信息，同时用于指导后续靶向治疗；④早期即可在血中检出，甚至早于影像学发现；⑤肿瘤分子分型是一种趋势，最新的分型方法基于突变类型和微卫星不稳定性，将传统的二分类法扩充为四类，而传统的CA125、影像学检查结果对新的分型没有意义。未来我们可能必须要获得肿瘤基因组信息才能开启一系列精准治疗方案，此时ctDNA检测可能会成为诊疗过程中不可缺少的一部分。


尽管前景光明，但是循环肿瘤DNA检测作为一种新兴技术，仍存有许多问题。首先这项技术只停留在实验阶段，缺乏统一的标准。如对于血样采集、DNA分离、检测手段等，不同试验研究中异质性非常大。其次，肿瘤的异质性决定了其基因突变位点多而复杂，如何确定最优的候选基因需要研究者们的大量的工作。最后，目前对于循环肿瘤DNA的检测手段仍不完善，组织学与血液学结果存在差异。因此短期内想要在临床中实现十分困难。


总之，循环肿瘤DNA液体活检技术在子宫内膜癌中具有独到的优势和很好的应用前景。尽管目前的应用较为局限，但是相信随着技术的不断发展，会有更多新的检测项目和手段被提出，其独特的临床价值会逐渐显现。


参考文献（略）