未合并卵巢癌的子宫内膜异位症:癌相关基因突变

作者:周彬 张师前 单位:山东大学齐鲁医院 来源:张师前 编者:
2018-7-30 阅读

子宫内膜异位症是一种相对常见的疾病,影响了大约10%的育龄期女性。在青春期盆腔痛的患者中其发病率高达50%。临床症状包括痛经、盆腔痛和不孕。子宫内膜异位症被认为是良性的、炎性的和雌激素依赖性的疾病。这种疾病常常引起多部位病变,包括盆腹腔腹膜和脏器。


有三种类型的子宫内膜异位症,包括表浅腹膜型、卵巢型和深部浸润型。深部浸润型子宫内膜异位症是浸润盆腔局部的结节状病灶。孕激素和GnRHa为主的内分泌治疗是子宫内膜异位症标准治疗方法。但是并不是所有的患者都能耐受药物治疗所带来的副反应,而且也并不是所有的患者激素治疗都有效,尤其是那些深部子宫内膜异位症的患者。外科手术切除也是治疗方法之一,特别是对有生育要求的患者。但是外科手术完整切除深部子宫内膜异位病灶需要较高的手术技巧,且手术是有风险的。


除了临床的良性行为和正常的组织学特征,深部子宫内膜异位症还具有恶性肿瘤的某些特点,例如局部侵袭和抗凋亡。子宫内膜异位症的病因学有争议,其起源有几个假说:撤退性出血使子宫内膜碎片通过输卵管迁移到盆腹腔腹膜,并在其浆膜层种植;子宫内膜细胞通过脉管播散;盆腹腔腹膜和脏器表面的体腔上皮细胞的转化;抑或骨髓来源干细胞或者胚胎残余苗勒氏管细胞在撤退性出血的过程中流进盆腹腔。


基因组相关研究已发现与子宫内膜异位症发病风险增加相关的遗传印记。子宫内膜异位症,尤其是卵巢子宫内膜异位症,被普遍认为是卵巢透明细胞癌和卵巢子宫内膜样腺癌直接的前驱病变,也因此叫做子宫内膜异位相关卵巢肿瘤。然而,对子宫内膜异位症体细胞突变的研究大部分限制在子宫内膜异位共存的恶性肿瘤当中。很少的候选基因的研究来研究良性(非癌相关)卵巢子宫内膜异位症。有一项试验证实了在某个单一病变中存在KRAS基因p.G12C的突变。另外一项研究证实在7/34的病变中存在PTEN基因突变(21%)。免疫组化研究证实在不伴癌的卵巢和非卵巢子宫内膜异位症病灶当中发生少见的ARID1A的免疫组化的丢失(意味着ARID1A的功能基因突变)。以上所有这些研究都是采用了低分辨率的基因测序技术,并且没有分离内膜上皮细胞和间质,同时也没用通过正交试验验证。因此,对于一些基本的问题仅能给出模棱两可的答案,例如:在子宫内膜异位相关卵巢肿瘤之外良性子宫内膜异位病变是否有体细胞癌症驱动基因的体细胞基因突变,如果有的话,它在这些病变的病因学当中发挥怎样的作用?

该研究中采用全外显子测序和靶向扩增子技术并用两种数字基因组方法检测是否良性的,但是有侵袭性的深部子宫内膜异位病变有体细胞突变,包括常常在癌症中发现的常常突变的基因。


组织标本分别从三组深部子宫内膜异位症的患者获取。所有组织均经福尔马林固定/石蜡包埋,或分子固定/石蜡包埋。样本组织均经病理学家证实深部子宫内膜异位症,均含上皮和间质细胞,没有癌症或不典型增生,标本的大小足够组织修剪、大体切割或激光捕获显微切割。


子宫内膜异位病灶和相应正常组织经组织取芯,切成2-3mm的蜡块,固定、包埋并HE染色。应用标准Illumina程序建立包含子宫内膜异位和正常组织样本的末端配对文库。编码区采用AgilentSureSelected系统捕获,并用Illumina测序。采用单分子条形码安全测序系统来减少组织固定和低突变频率带来的错误测序。净化后的产物采用Illumina MiSeq测序并分析突变。


ARID1A免疫反应性被用来做为ARID1A突变失活的替代物。福尔马林固定并石蜡包埋后的组织切片,用1:2000稀释的ARID1A抗体人工染色。


结果


实验研究的对象是非卵巢型的39名深部子宫内膜异位症的女性,平均年龄37岁。其中一组患者采用独立分子遗传分析引入用作平行对照,进行了非偏倚全外显子基因组测序,采用安全测序系统确认驱动基因突变,并且采用了免疫组化分析的方法;另一组患者采用微流体数字PCR技术确保四倍靶向PANEL为基础的测序;第三组单独采用微流体数字PCR分析。


全外显子测序分析


24名患者进行了全外显子基因测序(1到24号患者),从内膜异位症组织中提取DNA,并用正常组织做对照。发现了80个非同义体细胞突变,包含61个错义突变,5个无义突变,5个插入缺失突变产生的移码突变,7个框内插入缺失突变,另有2个经典结合位点突变。每块组织发生复变的的数目有较大差异(0到17),平均每块病变组织的突变数为3.3;有5块组织没有找到突变。等位基因突变频率通常较低(小于20%),说明只有一小部分的细胞发生了突变。有5块病变组织有癌症驱动基因的体细胞突变,2块组织发生了肿瘤抑制基因ARID1A的失活突变(p.L2253Cfs*14 in Patient 9 andp.G276Efs*87 )。活化基因突变的热点发生在PIK3CA(c.3127A→G;p.M1043V)(p.L2253Cfs*14 in Patient 9 and p.G276Efs*87,每个突变分别发生在一块组织。其他的突变都是与癌驱动基因无关的突变。


癌驱动基因如ARID1A,PIK3CA, KRAS, and PPP2R1A 等位基因突变频率从6%到17%不等,且与非癌症驱动基因没有显著差异。外显子资料也被用来评估DNA拷贝数,然而只有个10号病人获取了少量的拷贝数。


安全测序系统验证了体细胞突变的存在,并验证了等位基因突变频率。KRAS基因热点突变(15号患者)另外采用激光捕获显微切片的办法分离上皮和间质成分。发现突变发生在上皮而不是间质。ARID1A免疫活性的丢失做为突变失活的表现,在20号患者发现了这种情况(也是在上皮组织)。6号患者PPP2R1A上皮部分的突变被微流体数字PCR检测到,但是这位患者没有采集到单纯的间质样本。


癌症驱动基因深度测序分析


一组独立的实验分析了3位患者(25-27)的组织样本,采用两种靶向PANEL,分析了所有的5个基因(NRAS, BRAF, FGFFR2, HRAS, and KRAS) 的热点区域,6个基因(PIK3CA,PTEN, TP53, CDKN2A, CTNNB1, andFBXW7 )的全部编码序列。激光捕获显微切割分离两种组织成分,如果在4个PANEL都被发现,并且在DNA种系中缺如的话,就确认基因突变。在这3个患者中,有个2人有体细胞KRAS活化突变,然而,没有发现其他的体细胞突变。25号患者有c.35G→T和c.35G→TKRAS突变,等位基因突变频率分别在11.2%和8.6%。26号患者有单独的c.35G→T KRAS突变,等位基因突变频率10.4%。


KRAS基因突变通过微流体数字PCR验证。25号患者同一块组织的相邻的2个区域发生了c.35G→T 和c.35G→C的突变。分析验证了在同一内膜异位的上皮组织中存在两种突变:c.35G→T 的突变频率在两块组织分别是24%和37%, c.35G→C分别是33%和16%。


26号患者来自不同内膜异位病灶组织的2块病变的分析发现上皮组织KRAS c.35G→A突变,突变频率31%。KRAS突变在2组患者(3/27)中都被检测到,研究分析了另外12名患者(28-39号患者),采用微流体数字PCR技术检测5种KRAS基因12号密码子突变(c.35G→A [p.G12D], c.35G→T [p.G12V], c.35G→C [p.G12A],c.34G→C[p.G12R], and C.34G→T [p.G12C]) 。人工切割病变组织,如有阳性发现的话采用激光捕获显微切割,如有必要的话上皮和间质成分进行分别的微流体数字PCR检测是我们首次采用。12名患者有3人发生了KRAS基因突变(25%)。28号患者c.35G→A (p.G12D) 的突变,3块独立的病变组织和正常组织分别进行分析,3块解剖上完全独立的病变腺上皮组织都发生了KRAS c.35G→A 突变。然而,没能够发现该患者间质或者正常在位子宫内膜上皮的突变。


尽管人们发现子宫内膜异位症已经有一个世纪的历史,除了它的高发病率和它对女性健康相关生活质量的影响,其发病的生物学过程却知之甚少。从社会经济学的角度,也很有必要研究子宫内膜异位症的发病。仅在美国,每年因为子宫内膜异位症住院的患者,每次住院花费超过12,000美元,每年超过11,000的患者患此病,每年的花费超540亿美元。本研究联合采用二代测序技术、高敏感数字基因组技术研究良性的深部子宫内膜异位症病变,发现大多数病变有体细胞的突变,包括众所周知的癌症驱动基因ARID1A, PIK3CA, KRAS, and PPP2R1A。


研究对子宫内膜异位症病人基因突变的研究结果应审慎的对待,因为ultra-low-input测序技术和福尔马林固定组织的应用还有待进一步研究。应有更全面的基因组测序或表观遗传学的研究来证实更多的基因突变。尽管如此,研究所发现的基因突变以往更多的是在子宫内膜异位相关卵巢肿瘤,或者是子宫内膜异位相关卵巢肿瘤的远处的子宫内膜异位病灶当中的研究。需要特别关注的是,子宫内膜异位症通常被认为是良性的炎症性疾病,不伴有癌症的子宫内膜异位病变的癌相关基因突变(尤其是在很少恶性转化的深部子宫内膜异位症)的发现令人意外。这些突变是深部子宫内膜异位症的固有特点,也提出了对子宫内膜异位症发病的令人感兴趣的问题。


以往,对于子宫内膜异位症相关卵巢肿瘤伴发的子宫内膜异位症病变的研究显示了肿瘤组织和子宫内膜异位症组织均存在诱导子宫内膜异位症进展为癌症的基因突变。然而,子宫内膜异位症的恶性转化率约为1%,结果表研究明,仅仅是驱动基因突变既不足驱动子宫内膜异位症的恶性转化,也不足以证明病变向恶性转化的可能。除此之外,实验仅证实了少数的患者有驱动基因突变,现有的研究证明驱动基因并不是深部子宫内膜异位病灶向恶性转化所必须。也可能更重要的是,该研究对以往的研究提出挑战,以往的经典研究是把子宫内膜异位症相关卵巢肿瘤与子宫内膜异位症相关联,并研究单个候选基因突变,现在看来这些研究并不足以证明病变恶性转化的可能。


在80个突变基因中发现的5个驱动基因突变在125个驱动基因突变哭中的几率P=0.001(双端检验),也就是说,这种突变是偶然发生的几率非常低。因为驱动基因突变仅发生在上皮细胞而不是间质,可以假设,所观察到的基因突变为子宫内膜异位症上皮细胞提供了关键的选择优势。这种上皮细胞的显著的选择的压力导致同一病变的不同克隆种群。例如,25号患者有两种12号密码子KRAS基因突变。


深部子宫内膜异位症可以侵犯其他脏器,并改变局部解剖,然而在表浅的子宫内膜异位症亚型,并不发生局部浸润,但是解剖学的改变是有的。这些不同的表型背后的生物学过程仍然未知。我们的研究对目前具有侵袭性的子宫内膜异位症亚型的理解提出挑战,也提出了是否深部子宫内膜异位症可以被描述为一种良性肿瘤这样新的问题。28号患者在3处不同的病变组织中都发现了相同的KRAS基因突变,也提高了良性的深部子宫内膜异位症来自远处转移的新生肿瘤的过程。这些发现可以有几种解释。首先,突变的发生都是彼此独立的。然而,3块组织的同一突变单独发生的几率也很小。其次,突变可能在一块病变组织发生,然后转移到了其他位点。这种可能支持子宫内膜异位上皮细胞的远处转移的体细胞转化学说,但并不特别的支持子宫内膜远处转移或播散的学说。尽管如此,如果我们选择接受这种解释,也要考虑到还有没有突变的间质细胞的问题。间质成份是上皮细胞发挥作用不可或缺的部分,间质成份在子宫内膜异位症的发病过程中或者是共同移居,或者新招募。或者它在子宫内膜上皮细胞发生突变后通过非子宫内膜的间质细胞转化而来。最后,间质和上皮成份起源于子宫干细胞也有可能。干细胞相关理论可能为单个细胞远处转移提供支持,然而,这可能需要为迄今为止我们发现的癌症驱动基因突变仅发生在上皮细胞这一发现提供特别的解释。显然,这种假说需要更多的验证,但是它对于罕见的或者远处的子宫内膜异位症的发病更有说服力(例如肺、脊髓和脑)。


目前子宫内膜异位症的临床分型既不是根据生物学,也不是基于强有力的临床行为的预测。因此,有必要修正或者重新设计以生物学为基础的分型。此项研究为所有的子宫内膜异位症亚型提供了强大的有理的证据和分子学的基础来进行更深入的研究。


总之,尽管子宫内膜异位症无论从临床或是病理都被认为是良性的病变,众所周知的癌相关体细胞突变在一些深部子宫内膜异位腺上皮中被发现。这些发现为利用以往研究癌症的方法来更详细的解释子宫内膜异位症的所有存在形式创造了新的机会。


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