【作者简介】关立军，男，邢台不孕不育专科医院（邢台生殖与遗传专科医院）男性不育科主任。现任中国性学会会员，中国性学会生殖医学分会青年委员会常务委员，中国性学会基层泌尿男科分会第一届委员会常委，河北省中医药学会会员，河北省中医药学会男科专业委员会常委，河北省中西医结合男科学会委员，邢台市生殖医学会常委，邢台市男科学专业委员会候任主委。


从事泌尿生殖男科工作18年，擅长男性不育、性功能障碍、前列腺炎的诊治以及辅助生殖技术、男科显微手术，尤其对无精子症有自己独特的诊疗见解。曾在国家核心期刊发表论文数篇，并参与《男科学》第3版的审校工作及科普《让爱更长久》的编写。



摘要  目的 分析遗传学检查在极重度少精子症、无精子症患者群中阳性的检出率及其临床应用的意义。方法：1. 细胞遗传学检查：对患者外周血进行72小时培养，提取中期分裂相后镜检。2. 对染色体Y基因片段AZFa、AZFb、AZFc区上的6个位点，A组sY254 、sY127 、sY86三个位点，B组位点sY134 、sY84 、sY255三个位点，进行检测。结果 1. 检查146例极重度少精子症以及无精子症患者，染色体核型异常者有29例（19.9%），其中包括数目异常11例（7.5%），易位2例（1.4%），臂间倒位2例（1.4%），大Y 2例（1.4%），小Y 11例（7.5%）， 性逆转1例。2. 染色体Y基因片段检测发现单独 C区缺失13例（8.9%），B+C区缺失3例（2.1%），A+B+C区缺失1例（0.7%）。结论 本组数据显示了遗传学检查在极重度少精子症、无精子症患者中的阳性率可高达31.5%，因此也说明了极重度少精子症、无精子症患者病因中遗传学因素占有较大比例，遗传学检查是男科诊疗重要的检测项目，为临床是否继续药物或助孕治疗提供了重要依据。


关键词  极重度少精子症；无精子症；染色体核型；Y基因片段


Abstract : Objective:  To analyze the positive detection rate of genetic examination in group of patients with extremely less sperm or no sperm disease, and the meaning of its clinical application. Methods: 1. The detection of genetic examination： Made a microscopic examination after the 72 hours cytogenetic examination of peripheral blood in patients and extracting its medium-term division phase. 2. Made a detection on six sites of AZFa, AZFb and AZFc on molecular gene Y, which contains Y254, sY127, sY86 in group A, and Y134, sY84, sY255 in group B. Results: 1.As the detection results of 146 cases of extremely less sperm or no sperm diseases, there were 29 cases (20.0%) of abnormal chromosome karyotype, of which 11 cases (7.5%) were about the abnormal chromosome numbers, 2 cases (1.4%) of translocation, 2 cases (1.4%) of between-arm inversion, 2 cases (1.4%) of big Y and 11 cases (7.5%) of small Y. 2.The results of Y chromosome shown that there were 13 cases (8.9%) of C area lacking, 3 cases (2.1%) of B + C area lacking. 1 case (0.7%) of A+B + C area lacking. Conclusion: The positive rate of genetic tests between patients with extremely less sperm and no sperm disease can reach to 31.5%, thus it confirmed that the genetic factor has the absolute status in group of patients with extremely less sperm and no sperm disease，which can not be ignored, and provided a very important basis to determine whether can continue the drug treatment in the future or not, at the same time indicating the direction for future study on men's assist reproduction treatment.


Key words: extremely less sperm disease；no sperm disease；chromosome karyotype; 

Y molecular gene


近年由于环境的污染，不规律的生活方式，并且职场竞争愈演愈烈，男性在工作生活中的压力逐年加大，男性不育患者的人数明显增加【1】。男性精子的质量在某些地区呈现逐步下降的趋势，其医学原因非常复杂【2】。本文从染色体核型分析、Y染色体基因片段微缺检测两方面来阐述它们在男性不育检测方面的作用及意义。


近年由于环境的污染，不规律的生活方式，并且职场竞争愈演愈烈，男性在工作生活中的压力逐年加大，男性不育患者的人数明显增加【1】。男性精子的质量在某些地区呈现逐步下降的趋势，其医学原因非常复杂【2】。本文从染色体核型分析、Y染色体基因片段微缺检测两方面来阐述它们在男性不育检测方面的作用及意义。


一、研究对象与方法

1  研究对象

2013年7月1日- 2014年7月31日就诊于本院男科的患者（均为邢台周边地区人口），共146人，年龄22-40岁，平均年龄 27.5岁，精液常规分析为无精子症或极重度少精子症（精子密度< 2.0×106/ml）患者。


2  研究方法

2.1 进行外周血染色体检查，480条带以内G显带，每人计数20个分裂相，100×10倍油镜下分析4组细胞核型，如果发现有问题核型，累计计数至50个核型，并用其它显带方法进行鉴别，如C带或R带，结果按ISCN 1995标准命名。


2.2 进行Y染色体微缺失检查 ，运用多重PCR检测技术检测AZFa、AZFb、AZFc三个区域中的6个序列标签位点，每个样本做A组和B组两个多重PCR反应，A组包括sY254 、sY127 、sY86三个位点，B组位点包括sY134 、sY84 、sY255三个位点，每一组设置扩增SRY基因。


二、结果

对146例极重度少精子症和无精子症患者进行外周血染色体核型和Y染色体基因片段微缺失检测，检出极重度少精子症以及无精子症患者中染色体核型异常者有29（20.0%）例，其中包括47，XXY 10例（见图1），47，XYY 1例，罗伯逊易位1例（见图2），数目异常共11例（7.5%），平衡易位2例（1.4%），臂间倒位2例（1.4%），大Y 2例（1.4%），小Y 11例（7.5%）。发现 C区缺失13例（8.9%），B+C区缺失3例（2.1%）（见图3），A+B+C区缺失1例（0.7%）。

图1     检出易位45，XY,t(14q;21q) 


图2  检出克氏征核型47，XXY


图3  Y染色体AZF区基因检测第1组，第4组 B+C区缺失


表1  染色体核型检查阳性核型分布情况


表2  Y染色体基因位点sY254 、sY127 、sY86 、sY134 、sY84 、sY255阳性分布情况


表3 染色体核型检查和Y染色体基因片段检查阳性情况汇总表

备注：本文所检测样本中有3例患者染色体核型是46，XY，Y≤21，同时伴有Y染色体C区片段丢失2例，伴有B+C区片段丢失1例； 1例患者染色体核型为女性核型46，XX 经Y染色体基因片段检测确认有A+Ｂ＋C区缺失 SRY基因存在，内分泌检测支持克氏征诊断。


三、讨论

 精子的发生受到有序表达基因的控制，染色体异常以及Y染色体基因片段的缺失可以不同程度的对精子的发生造成影响，使男性的生殖能力下降，在男性不育的就诊人群中染色体异常的发生率大约可达到正常人的5倍，尤其是在极重度少精子症和无精子症患者群中，发生率更高。基于以上观点我院统计的146例极重度少精子症和无精子症患者群中，异常检出为46人，阳性率达31.5%。通过以上数据统计，我们从染色体核型异常和Y 染色体微缺失两个方面来证实极重度少精子症和无精子症患者在遗传数据的表达以及在不孕不育人群中的发生情况。


1.染色体核型异常与不育患者的关系


染色体异常除导致绝大部分受累胚胎死胎流产外，另外一小部分出生的孩子，由于染色体异常而可能发生问题，哪怕是微小的畸变都将会涉及许多基因，所以即便是出生的孩子也有可能会出现先天的多发畸形，肢体发育缺陷、智力低下等综合征症状。性染色体异常患儿还会出现内生殖器、外生殖器异常或者畸变以及生育力丧失的问题。本文检出克氏征10例，异常检出率为6.8%，分析其是造成无精子生成的主要原因之一，是因为有多余的一条X染色体，它的剂量效应影响到睾丸的生精小管上皮细胞的发育。临床多表现为小睾丸、小阴茎、第二性征不发育等，实验室精液检查无精子，血FSH、LH升高，T降低，睾丸活检生精小管透明样变、基膜增厚、生精细胞萎缩，而间质增生。这种情况药物治疗是对患者的精子生成没有效果的，但可通过睾酮的治疗促使第二性征发育以及解决性生活问题。


本文染色体平衡易位和罗伯逊易位共2例，占不孕人群的1.4%。染色体易位可引起精子质量下降甚至无精子，此2例均为极重度少精子症，假如通过ICSI辅助受孕将有流产、死胎、或者发育畸形的可能。因此建议，做植入前遗传学诊断，或者孕后做产前诊断，防止患儿出生。


检出小Y 11例，阳性率为7.5%。大Y 2例，阳性率为1.4%。Y染色体是介于18-22号染色体之间的近端着丝粒染色体，长度相对较小，并且染色体长短臂上包含的基因数量不是很多。Y染色体属于异染色质，它特别容易发生形态学变化，主要表现为Y染色体长臂的增长和缩短。在男性正常人群中【3】，Y染色体表现出的变异主要是长臂远端异染色质长短的差异，有人【4】认为由于Y异染色质的一部分或者完全丢失，都会导致常染色质序列疏松，结果是造成其不能正常的发挥其基因功能和精子生成能力下降，还有研究【5】认为是Y染色质排列过度紧密影响其基因作用。Y染色体长度的变异可在临床上产生一定的症状，导致孕妇流产或者胎儿畸形【6】 ，它长度的缩小会引起无精子或精子异常从而引起不育【7】。在研究的过程中显示11例小Y异常不同程度的影响了精子的发生。绝大多数Y染色体较小的男性，精子质量不同程度的下降，但是身体其他方面都很正常，这点与Vogt的报道有相同特点【8】。我们分析染色体变异大多数是发生在胚胎发育早期阶段，因为染色体变异主要引起的是早期胚胎发育异常，细胞的分裂和分化是早期胚胎发育障碍的主要因素，引起发育障碍的机制与细胞分裂相关，所以Y染色体的大小变异可以使细胞分裂的同源染色体配对成功率下降，从而影响到细胞分裂，进一步导致胚胎发育受损，造成不良的妊娠结局。因此提示Y染色体长度的变化并非是完全没有临床意义的，不要简单认为是遗传学多态性，发生这种情况我们应高度重视和对待。


2. Y 染色体微缺失与不育患者的关系


研究检出Y基因片段缺失共17例，其中C区缺失13例（8.9%），10例无精子生成，3例极重度少精子症（精子密度<2.0×106/ml）。B+C区缺失3例（2.1%），均无精子生成。A+B+C区缺失1例（0.7%），无精子生成。Y染色体上的基因对男性生殖细胞的发育起调节作用，分为上述提到的AZFa  AZFb  AZFc三个区域。AZFa区缺失较为少见,占整个AZF缺失的4 .9%，为绝对的无精子症。若患者为AZFa缺失则不建议做睾丸穿刺或切开寻找精子，目前只能寻求供精通过助孕技术来获得后代。AZFb缺失也不多见，占整个AZF缺失15 .8%【9】。缺失的典型睾丸组织学特征是精子成熟障碍,主要停滞在初级精母细胞阶段，睾丸穿刺不能获得精子 ,因此 ,临床上也不建议做睾丸穿刺或切开取精。AZFc缺失是临床上最常见的AZF缺失类型 ,临床和睾丸组织学表型为多样化。一般说来 ,AZFc缺失患者可能尚存有精子生成能力，AZFc缺失可见于无精子症或极重度少精子症患者 ,罕见情况下 ,也可能在自然状态下遗传给其男性后代，部分有精子患者，精子数目有进行性下降的趋势，最后发展为无精子症[10]。在无精子症患者中,AZFc缺失者通过睾丸取精获得精子的机率要比其他缺失类型高 ,而获得的精子可行ICSI助孕 ,但这些患者的男性后代同样都将是AZFc缺失的携带者，建议在助孕前行遗传咨询。越来越多的研究证实AZF区基因的缺失与男性不育紧密相关，并且会遗传给男性后代，且相同遗传类型可有不同的临床表现，其比例约占7%-15% [11]， 即Y染色体微缺失是男性原发不育的一个重要遗传因素，它可在父子之间垂直传递[12]，可能会增加后代的医学遗传问题发生风险以及先天性畸形的风险。在自然人群中，由于AZF缺失患者大部分不能生育，该缺失一般不会遗传给后代。


Y染色体微缺失除了会引起男性不育及精子质量下降外还是反复自然流产的发病因素，原因可能是Y染色体微缺失患者非整倍体精子比例增高，导致非整倍体胚胎的比例也增加，而且单个位点的缺失发生机理是可能影响胚胎发育过程中滋养叶细胞功能的，使滋养供应障碍，对胚胎的发育形成影响。欧洲男科学会认为现在6个位点（sY254 、sY127 、sY86 、sY134 、sY84 、sY255）的检测可以检出95%左右的Y染色体片段丢失。


目前育龄夫妇中，有50%是由男性因素引起的，常见的原因有内分泌因素、遗传学因素、感染因素、精索静脉曲张、隐睾、免疫因素、性功能障碍等，其中遗传缺陷包括基因突变和染色体异常所引起的精子发生障碍占30%以上[13]。通过本文的数据显示，极重度少精子症和无精子症患者的染色体核型异常以及Y染色体基因片段的缺失高达31.5%，可见对男性不育患者进行系统的遗传学检查，是有助于病因诊断，一旦确诊可避免患者的不必要治疗。同时对异常核型者进行家系的遗传学分析，可减少缺陷患儿出生。但是我们也要清楚目前的研究虽然表明Y染色体上存在众多与生长、生殖以及精子发生有关的基因[14]，但并不能证明所有男性不育、精子发生异常等都能在Y染色体上找到原因。精子产生是一个需要多基因、多途径、多靶点共同作用的结果，我们相信随着不断对分子遗传学，生物学的研究以及加上Y染色体基因图谱的不断完善，我们会更加明确精子生成障碍的原因，并且实现基因治疗的愿望。


考 文 献 参

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[4]石化金．Y染色体异常的临床表现及遗传学研究．中华医学遗传学杂志，1992，9(5)：306．

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