陈强  谢龙旭  李烈军  林敏   李辉  毛玲之  杨利业

潮州中心医院中心实验室;吉林大学公共卫生学院;广东潮州凯普生物科技股份有限公司;潮州市卫生局;饶平人民医院;潮州医院妇产科;潮州妇幼保健院;潮安医院妇产科;广东省妇幼保健院

 

摘要

背景: HPV感染是导致宫颈癌的主要原因。目前关于中国农村地区人群HPV感染情况流行病学的详细资料和报导很少。 

材料和方法:收集潮州农村地区妇女宫颈脱落细胞,首先用多重荧光PCR方法进行检测,该方法能够检测出包含HPV1618313335394551525658596813种高危型别。HPV阳性的样本再进行HPV分型检测。HPV阳性样本同时进行LCT细胞学检测,异常的继续进行组织学检测,组织学异常的按照规程进行手术治疗。

结果:48559名受检者中,高危荧光检测发现有3830名妇女检测到HPV DNA7.89%)。在55~60年龄段有一个感染高峰。同郊区的、山区和沿海的人群相比,居住在平原地区的发生率较低。3380HPV阳性的样本进行基因分型检测,其中11.01%的样本无法分型。在分出型别的3008个样本中,6种最常见的HPV感染型别分别为5233.4%),1620.95%),5815.93%)、339.94%),689.22%)和188.36%)。HPV16HPV18合起来占总体感染率的28.52%。而HPV52HPV 58占总体感染率的48.23%。 2209/2907为单一感染,而698/2907为多重感染。其中HPV多重感染随着年龄的增加而提高,高峰发生率在55~60岁之间的人群。在2077名高危阳性感染中,LCT异常的占12.3%LCT异常的行组织学检测,异常的占60.39%。其中CIN3及以上的有67例,均得到医院有效的治疗。

结论:我们的研究结果表明HPV-52-58型别的感染率要高于目前宫颈癌疫苗保护的HPV-16-18型别,该结论支持如下假设:开发包含HPV-52-58型别的第二代预防性疫苗可能为农村地区的妇女提供更好的保护。

前言

宫颈癌是女性第二大常见癌症,全球每年约有200,000人死于宫颈癌。因此该病仍有极大的社会影响。某种类型的人乳头状瘤病毒(HPV)被认为是宫颈癌的主要因素。目前已按分子特点分类已有超过100种的HPV基因型。根据以前的报告,HPV-16-18-3133-3539-45-51-52-56-58-68-73-59-82被归为“高危型别”,与宫颈癌相关,而HPV-6-11-42-43-44被定义为“低危型别”。针对这些感染的预防性疫苗的开发似乎是目前控制宫颈肿瘤最有希望的方法。现有两种HPV疫苗已经获得许可证。疫苗加德西Gardasil (HPV-6/11/16/18) 卉妍康 (Cervarix) (HPV-16/18)主要针对这两种主要致癌型别(HPV-16/18)。这些疫苗还可以降低有关HPV良性病变的经济负担,兼具安全、耐受性佳和高度免疫的特点。临床试验显示,对生殖损伤的限定型别的保护效力与女性的目标型别相关,这些登记在列的女性对其各自感染的型别是毫不知情的。由于HPV型别间存在有限的交叉保护,预测现用预防性疫苗和形成针对特定区域二代疫苗的基础资料应当考虑到不同人群HPV特定型别分布的不均匀性。

据我们所知,目前还没有关于广东省(中国南方)农村地区普通女性的HPV基因型流行病学资料的报告,而该地区迫切需要及时的以人群为基础的研究。归功于易于接近的采样解剖位点和完善的宫颈采样方法,我们调查了无症状、普通女性群体的宫颈HPV感染情况,以了解广东省农村整体、特定型别和特定年龄的HPV患病率和多重感染的程度。

方法

研究对象

200910月到20109月,潮州市政府组织,联合13家医院(潮州市中心医院、潮州市人民医院、潮安县妇幼保健院、枫溪区医院、饶平县人民医院、饶平华侨医院、新丰人民医院、桥东卫生院、意溪卫生院、城西卫生院、凤新卫生院和饶平县妇幼保健院)的妇科从业者开展HPV感染的流行病学筛查。

潮州农村地区符合本次调查的人群包括大约300,000名妇女(年龄从35~60岁)。大多数合格人群拒绝参加主要是因为她们没有足够的时间或者觉得没症状就没必要进行妇科检验。合格入选为研究对象的条件是: (a)身心健康;(b)年龄在35~60岁之间;(c)当地常住居民;(d)无异常细胞学病史或子宫-阴道发育不良;(e)无其他HPV相关疾病的病史或关联症状;(f)至少生育过一次;(g)目前没有怀孕;(h)无全子宫或宫颈切除术史;(i)自愿接受HPV检测。

研究设计

邀请合格妇女参加一次面对面的谈话,以问卷方式了解社会人口统计特征,问卷内容包括生活方式、月经状况、生育史、节育及性生活情况。通过签名或按指纹获得知情同意。面谈结束后,所有妇女接受妇科检查,由各村卫生院或上面提及的13家医院的妇科从业者进行检验,宫颈脱落细胞用于HPV DNA检测。3家医院(潮州市人民医院、饶平县人民医院、潮安县妇幼保健院)首次采用多线路传输实时聚合酶链式反应(PCR)检测高危型HPV。然后,同一高危型HPV样本在中国潮州凯普生物科技有限公司(下简称凯普公司)进行HPV基因型检测,分出具体的亚型。对于实时荧光PCR检出的HPV DNA阳性病例,如果有必要,建议其接受液基细胞学检查(LCT)和组织学诊断。大多数确定或者高度怀疑高度或浸润性病变的患者根据当地协议在合作医院接受宫颈环切术、锥切术、子宫切除或放射治疗。参与者无需为筛查和接下来的细胞化验支付费用。所有研究都是经潮州市中心医院伦理委员会批准的。设计的细节图如图1所示。

分组

潮州地区地处中华人民共和国广东省的最东部。它南邻汕头市,西接揭阳市,西北毗梅州市,东与福建省交界,东南部是中国南海。它按照地市级城市管理,总辖区面积是3,614平方千米,总人口是2,600,000。潮州的市政区域包括一个城市(湘桥区和枫溪区),共有840个自然村(图2)。

对于年龄患病率,合格对象被分为5个年龄组,每一对象的实际年龄用Microsoft Excel软件按如下公式计算:(采访日期-生日)/365.25。对于区域患病率,合格对象被分为4个地区组和41个自然村,根据他们的居住地分为郊区(2个村落)、平原(18个村落)、山地(16个村落)、海滨(5个村落)(图2)。

宫颈人乳头状瘤病毒DNA样本采集和提取

宫颈脱落细胞样本用塑料宫颈棉签进行采集。将采样器插入宫颈管1~37.5px并逆时针旋转4~5圈。装有细胞物质的棉签顶端被放入转移介质管并立即保存于4℃。没有知识的受试者对样本进行编码。棉签和装样本转移介质的保存管均由潮州凯普公司提供。所有样本最后被送到3家临床PCR实验室(潮州市人民医院、饶平县人民医院、潮安县妇幼保健院)进行HPV分析。离心(相对离心力960g5分钟,移去采样刷和上清液。用凯普公司提供的细胞裂解试剂盒将DNA从沉淀物中提取出来,在100μL的洗脱液中重悬细胞,准备进行PCR或存储于-20℃。

 

HR-HPV DNA实时荧光PCR

高危型HPV(HR-HPV)感染采用多线路实时荧光PCRABI Stepone 热循环仪上进行检测,扩增按照制造协议进行(中国潮州凯普生物科技有限公司)。

这个实时PCR检测试剂盒可以检测13HR-HPV的感染(161831333539455152565859 68),但不能区分具体型别。

HPV基因检测

实时荧光PCR具有相同DNAHR-HPV阳性样本进行HPV基因检测。HPV基因分型由集DNA扩增、导流杂交和基因芯片于一体的导流杂交仪(潮州凯普公司)完成。按照产品指南进行检测。之前已有这种分析方法的详细步骤。[12]这种基因芯片包含型特异性寡核苷酸,固定于尼龙膜上。这种芯片可以定义为13种高危HPV(HR-HPVs) (16183133353945515256585968)5种低危HPV(LR-HPVs) (611424344)和中国人群常见HPV5356CP8304。最终结果可以通过肉眼直接对芯片位点的颜色变化进行判读。

液基细胞检测(LCT)和病理学诊断

建议实时荧光PCR检测为HPV DNA阳性的病例接受LCT3家医院(市中心医院、饶平县人民医院和潮州市妇幼保健院)有开展此项目。这些妇女被召回并采集其宫颈脱落细胞,混在3mL标本保存液中(凯普公司),室温保存。这些标本被送到上面提及的三家医院进行LCT分析。结果用Bethesda系统进行评价[13]。评价体系包括:(i)阴性, (ii)非典型鳞状上皮细胞(ASC) (iii) 低度鳞状上皮内病变,(iv)高度鳞状上皮内病变, (v)鳞状细胞癌。

建议LCT病例异常者进一步接受阴道镜检和活检。所有CIN23,浸润癌或原位癌的病例根据当地协议接受转化区的环切术、锥切术、子宫切除或放射治疗。

统计分析

所有数据用SPSS16软件进行分析。评估各个年龄组和生活地区组的HPV DNA感染率采用卡方检验法。线性回归分析用于评估年龄和多重HPV型感染构成比之间的关系。当P值小于或等于0.05时接受其具有统计学意义。所有P值都是双边的。

结果

HR-HPV患病率

在本项目启动时,总共有49458名妇女参加本次调查,并完成问卷,但899名妇女不满足入选标准而被排除,主要因为她们的年龄或全子宫或宫颈切除术(图1)。

48559名合格的潮州农村妇女中,实时荧光PCR显示3830HR-HPV DNA阳性,毛感染率是7.89%3830/48559)(图1)。

年龄在35~55岁,HR-HPV的患病率在7.28% ~ 7.88%,均低于毛感染率7.89%,各组间差异没有统计学意义(P0.05)。然而, 55~60岁年龄组HR-HPV感染率(9.39%)显著高于其他四组(P0.001)(表1,图3)。不同于我们之前的报道[12],患病率没有呈现随年龄增加而增长的趋势,而是在最老的年龄组出现一个感染高峰图(3A)。

居住在海滨的妇女HR-HPV患病率最高,其次是住在山上的,再次是住在郊区的。这三个地区的HPV感染率从9.61%下降到8.45%,虽然如此,它仍然高于毛感染率7.89%,且这三组没有显著差异(P0.05)。仅有居住在平原地区的妇女HPV盛行率(7.31%)低于毛感染率,且显著低于其他三组(P0.01)(表2,图3B)。

郊区、平原、山地妇女也观察了特定年龄相关的患病率,在55~60岁年龄组均有一个感染高峰。然而,居住海滨的妇女却有显著不同,就此,HR-HPV感染率在35~50岁间逐年上升,老年组则下降(图3C)。

HR-HPV各型别患病率

3380HR-HPV阳性病例接受HPV基因检测,372(11.01%, 372/3380)没有结合任何探针(21种亚型),被归为HPV-X型。在这已分型的3008例中,101例确认没有HR-HPV型感染,而2097例均检测到特定的HR-HPV型,在这些病例中,2209(75.99%)仅感染单一的HR-HPV型,698(24.01%)感染多种型别(图1)。

 

与我们之前的报导一致,52亚型是最常见的HR-HPV型,超过1/333.40%)感染了该型别(包括单一感染和多重感染)。另外5种最常见HR-HPV型别递减排序依次是:16 (20.95%)58 (15.93%)33(9.94%)68 (9.22%) and 18 (8.36%) ( 3)

在这2907HR-HPV型病例中,每种型别个有一个独特的年龄相关患病率,我们没有发现高龄组有任何与实时荧光PCR一致的HR-HPV发病高峰。同样地,平原地区妇女也没有比其他三地更低的感染率(表45)。6种最常见HR-HPV型的年龄和地区感染率如图4 AB所示。

所有HR-HPV感染病例中HPV16型和18型感染率之和达到28.52%。然而52型加上58型则高达48.23%。有趣的是,16型和18型患病率随着年龄的增加缓慢下降,而52型和58型患病率随年龄增长逐渐上升(图4C)。

HR-HPV通常感染单一型别,如前所述,超过3/4(75.99%)基因分型病例都是单一感染。对于HPV多重感染,主要是两型感染,接近多重感染的3/4 (72.78%, 508/698)。大约1/5的病例(139/698)是三型感染,只有7%的病例感染了四种或以上的HPV亚型。最多的几个病例感染了7中不同亚型。感染频率的患病率见图5B

最常见的感染类型参与了最常见的多重感染情况,比如,52型和16型联合感染是两型感染中最常见的。主要HR-HPV多重感染见图6

此外,我们发现多重感染的构成比逐岁增加,且有线性回归关系,R的平方是0.783,线性回归方程是:Y =2 0.054+ 0.006X(图5C。郊区、平原和山地的妇女都有这种趋势。对于海滨妇女来说,这种趋势仅出现在35~50岁之间,50~55岁之间出现一个患病高峰,往后则逐岁下降(图5D)。但4个地区多重感染的构成比没有显著差异。此外我们还观察了6种最常见的HR-HPV5216583368  18型的年龄和地区相关的患病率(图5F5G)。

细胞学检测、诊断和治疗

    共有2077名感染了特定HR-HPV型别的妇女接受了LCT12.3%(255/2077)LCT异常的妇女接受了组织病理学诊断,病理学异常的(CIN1或以上)达到60.39% (154/255)。共确诊了67CIN3或以上的病例,且她们都再医院接受了适当的治疗。她们中26(38.8%)感染HPV-162 (3.0%)感染HPV-18 2 (3.0%)感染HPV-523(4.5%)感染HPV-58,其余(34例,38.8%)为多重感染或感染了以上未提及的亚型。感染了X亚型的近150名妇女接受了LCT,其中4名妇女检出病理学异常(3CIN11CIN2),X亚型组未检出CIN3或以上病例。

讨论

直到近期,中国才开展针对宫颈癌筛查的大型HPV检测,基于第II代杂交捕获法的技术(HC- II) [14]。已经在中国使用了相当长时间的HR-HPV检测的实时多重PCR(中国凯普)显示了与HC-II的高度一致性[15,16]。在当地政府的支持下,我们在潮州农村地区组织了一次基于实时多重PCR的针对宫颈癌筛查的大型HPV检测。考虑到实时多重PCR检测无法分型,我们采用了21种HPV亚型分型检测(中国凯普),包括了已确定的13种高危型别。

与中国的同类调查相比,广东省潮州市农村地区的HR-HPV患病率(7.8%)与西藏的(7.05%)接近[17],也接近澳门[18]以及我们之前调查过的潮州市区女性的患病率(6.52%)[12],但低于中国北部的北京(9.9%),东南部的浙江[20],和一个南部城市(17.6%) [21]。在潮州农村地区,约有300,000名35~60岁的妇女有资格参加这次筛选。即使只有20%的妇女参加,也不会引起大的偏差,因为HPV感染是无症状的,且近50,000(20%)个样本足够大[19]。我们的研究人群是没有子宫肿瘤或其他HPV相关疾病史的无症状妇女。由于成本限制,我们对本次研究的所有参与者没有执行基于细胞学检测的Bethesda体系术语,只有HR-HPV的妇女接受了细胞学检测。

普通女性人群中最常见的HR-HPV亚型是HPV-16、-18、-31、-58、-52、-51-33,而排序因地区而异[22]。与多数以前的研究 [19,21,23,24] 和其他人群[22]相比,HPV-52多于HPV-16,是农村人群中最常见的确定类型(占所有型别病例的33.40%),与中国的广东省[25]、潮州市 [12]、澳门[18]、浙江省[20]和日本[26]的资料一致。HPV-16排名第二,患病率(占所有型别病例的20.95%)比得上世界范围的。HPV-52HPV-16更普遍,这一结果可能是由于HPV型别与宿主免疫原性因素之间的地理、生物的影响[22,27]。另外的解释可能归因于基因分型系统[28,29]HPV-58,另一个亚洲人群常见的型别[18,25],排第三(占所有型别病例的15.93%),与日本接近[26]。有趣的是HPV-68在其他调查中不是非常常见[3,4,22],在我们的调查中排名第六,表明潮州农村地区HR-HPV独有的分布。

在之前的研究中,HPV-52和-58是在广东省使用HPV基因序列检测试剂盒的中国女性中最常见的基因型[12]。刘等人报导了HPV基因检测试剂盒对HPV-52具有高灵敏度,也可以检测出量小至10-50拷贝的HPV-16和HPV-18。基因序列检测和Roche Linear Array (LA)HPV 基因测定显示,在检测HPV基因分型率上两者没有显著差异,且分析一致性很好[29]。此外,后续测序研究表明基因序列是基因分型的可靠方法(数据未显示)。所以,我们研究的感染人群中HPV-52和-58占48.23%的优势是有意义且有说服力的。

本次筛查包括一轮HR-HPV的实时荧光PCR检测和13种HR-HPV亚型的大样本对象的基因分型。然而,仍有372例HPV DNA阳性病例不能用基因检测进行分型(X型)。我们推断最可能的原因来自实时荧光PCR和基因检测两者灵敏度的差异,厂商声明的灵敏度前者是50拷贝,后者是300拷贝。事实上,我们发现这些X型病例的平均周期阈值(CT)远高于已分型的病例(数据未显示)。所以,我们相信这些X型的主要原因是感染了相对低的病毒载量。

就目前可用的预防性疫苗,疫苗类型(HPV-16 and HPV-18)的普及率在研究中各年龄组都持续偏低(占所有型别病例的28.52%)。由于研究表明HPV-52和-58在潮州农村人群中占主导,甚至超过了HPV-16和-18,我们假定包含HPV-52和-58的第二代HPV疫苗可以为潮州妇女提供更多保护。

之前的研究中普遍存在的HR-HPV双峰年龄分布,在当前的研究中并没有出现。潮州农村地区老年妇女(55~60岁)多重感染最多,其次是50~55岁年龄组,这表明年长者感染HPV的可能性更高[12]

因为HPV容易在性启蒙期获得[4,5],实际HPV感染的第一次高峰可能在20岁之前,这个年龄组不在我们调查之列。此外,潮州农村地区老年妇女(55~60岁)多重感染最多且多重感染率随年龄逐渐上升,多重感染构成比和年龄之间呈线性相关。本研究中观察到的老年妇女的感染高峰可能是因为持续感染或绝经期的激素波动导致生理和免疫失调从而激活潜在的HPV [12,27]。55~60岁的妇女HR-HPV阳性意味着病毒持续感染的可能性更大,这使老年妇女的HPV筛查比年轻女性更有意义。进一步评估,HR-HPV阳性的老年妇女应当考虑进行细胞学检查甚至阴道镜检,且常规筛查应当延长因为她们有更高的宫颈癌致癌风险。

我们也探讨居住地对HR-HPV的影响,我们提到的4种类型的居住地,包括郊区、平原、海滨和山地。山地的感染率与其他3组有显著差异。郊区居民与城市居民为邻,深受城市妇女影响[12]。潮州农村平原地区工业发达,人民就在本地工作,很少外出打工。然而,海滨和山地有许多村民远离家乡外出工作(数据未显示),使夫妻分离,为婚外情提供了机会,从而增加了HPV感染的几率,因为那些地区妇女的性观念和性行为相对保守,男性拥有多性伴可能是女性感染HPV的主要来源,因为HPV主要是通过性交传播[30]

之前的研究显示高危性行为包括过早性启蒙、多性伴和性伴是HPV携带者,均是女性感染HPV的重要因素[20,31]。我们还试图探索各种类别的HPV阳性的独立预测因素,然而,在中国广东公布的潮州农村地区,绝大多数妇女都拒绝回答有关性行为的问题,所以我们无法获得影响HPV感染的与性行为有关的独立指标。

许多报告支持HPV检测作为宫颈癌的初筛检测[14,26]。据我们所知,这是在中国广东农村地区首次以人群为基础的研究。HPV-DNA(凯普)的实时荧光PCR具有快速、简便、实惠且准确度基本等价于HC-II的特点[15,16]。在成功建立低价、崭新的实时HPV-DNA检测平台的情况下,使用单一HPV检测有望在卫生保健基础设施无法负担细胞学检测系统的欠发达地区单独作为初筛技术。

结论

我们报导了以人群为基础的中国广东省农村地区48559名妇女的HPV筛查结果。筛查包括一轮HR-HPV实时荧光PCR检测和13种HR-HPV亚型的大样本对象的基因分型。本研究以人群为基础的性质为中国农村地区HPV感染研究提供了之前无法估计的全局患病率。来源于该分析的横断面信息应该有助于HPV疫苗的设计。这些数据显示了可用的HPV疫苗类型患病率低和患病率相对高的HPV-52和-58。该结论支持如下假设:开发包含HPV-52-58型别的第二代预防性疫苗可能为农村地区的妇女提供更好的保护。此外,我们的数据也吻合感染HR-HPV的55~60岁妇女的调查。本次HPV-DNA筛查试验容易执行且经济实惠,极可能在中国的其他农村地区开展。

致谢

我们诚挚地感谢参与本次研究的全体员工和参加者。特别表扬在样本搜集中表现出色的员工。还要感谢潮州市卫生局组织本次筛查。感谢廖秦平(北京清华长庚医院,妇产科)和刘宏图(中国病毒性疾病预防和控制研究所致癌病毒科,国家疾病预防控制中心,中国北京)提出的宝贵意见。

作者贡献

构思并设计实验:LYY LXX QC SMZ。执行实验:QC ZRQ LJL ZYL ML BZL WZC QLL HL WPC PYZ LZM CYC CY YZZ XZL JKZ LYY。分析数据:QC LYY。论文写作:LYY QC

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