·临床论著·

二至天癸方对 IVF-ET患者颗粒细胞凋亡的影响

连 方1 相 珊2


摘要 目的 观察二至天癸方干预调节 Pl3K/Akt 信号通路关键效应分子 p-Akt、Pl3K及与通路相关的Bad水平对肾气虚体外受精"胚胎移植(IVF-ET)患者卵细胞质量的影响% 。方法 选取行IVF-ET的肾气虚不孕症患者80例,按照随机数字表法分为治疗组(二至天癸方结合IVF-ET治疗),安慰剂组(安慰剂颗粒IVF-ET结合),每组40例,另选取40 名因男方因素行IVF-ET的女性志愿者为健康对照组(安慰剂颗粒结合IVF-ET 治疗)。3组患者均于促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)降调节的前一周期开始加服二至天癸方或安慰剂颗粒至人绒毛膜促性腺激素(HCG)注射日停药。观察 3组患者临床妊娠率、颗粒细胞凋亡率。Western blot法检测Pl3K/Akt信号转导通路p-Akt、Pl3K、Bad蛋白水平。结果 与健康对照组比较,安慰剂组Pl3K、p-Akt蛋白表达量降低,Bad蛋白表达量升高(P<0.05,P<0.01) ;与安慰剂组比较,治疗组Pl3K、p-Akt蛋白表达量升高,Bad蛋白表达量降低(P<0.05,P<0.01) 。与安慰剂组比较,健康对照组及治疗组卵巢颗粒细胞凋亡率均降低,临床妊娠率增高(P<0.05,p<0.01)。结论 二至天癸方可能是通过Pl3K/Akt信号转导通路,下调Bad因子表达,抑制颗粒细胞凋亡,从而提高IVF-ET患者卵细胞质量,最终改善肾气虚不孕症患者的IVF-ET结局。


关键词 二至天癸方; 肾气虚;Pl3K/Akt 信号转导通路;体外受精-胚胎移植


现代医学认为卵巢颗粒细胞是卵巢内的主要功能细胞,是卵泡内最主要的体细胞成分,其增殖、分化直接影响卵泡发育、卵子成熟、减数分裂及能量供应[1-3]。课题组前期研究已证实,二至天癸方能改善肾气虚型体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF)患者的肾气虚症状,提高患者的受精率、优质胚胎率以及临床妊娠率,并能干预蛋白的表达[4]。在此基础上进行信号转导通路的研究,为深入诠释“肾主生殖”的科学内涵提供了可能性。


资料与方法


1  诊断标准 不孕症的诊断标准:性生活正常,未避孕≥1 年未孕者,称为不孕症[5]。 从未妊娠者称原发性不孕;曾经妊娠而后未再妊娠者称为继发性不孕。不孕症输卵管因素诊断标准参考中国中西医结合学会妇产科专业委员会第三届学术会议——子宫内膜异位症/妊娠高血压综合征及女性不孕症的中西医诊疗标准(6)。


不孕证肾气虚辨证标准参《中药新药临床研究指导原则》[7],主症:不孕;腰膝酸软或足跟痛;经色暗淡或经质稀薄。兼症:头晕耳鸣;小便清长或淋漓不尽;大便溏薄;性欲淡漠;神疲乏力;心悸气短;反应迟钝或健忘。典型舌脉:舌质黯或淡红,苔薄白,两尺脉沉细或沉细弱。同时具备 2项主症及兼症中的1~2 项,参照舌脉即可诊断。


2  纳入标准(1)符合上述诊断标准;(2)近2个月经周期未使用激素类药物者;(3)签署知情同意书者;(4)生殖内分泌水平符合降调标准。


3  排除标准(1)患有严重的精神疾患、泌尿生殖系统急性感染、性传播疾病者;(2)近期接触过射线并在作用期内者;(3)具有吸毒等严重不良嗜好者;(4)子宫不具备妊娠功能或严重的躯体疾病不能承受妊娠者。


4  脱落标准 因各种原因未按规定完成治疗者。


5  一般资料 120 例患者均为2014 年3月—2015 年1月就诊于山东中医药大学附属医院中西医结合生殖与遗传中心行 IVF-ET 治疗的肾气虚不孕症患者,按照随机数字表法分为二至天癸方治疗组和安慰剂组,每组 40例。另选取 40 名因男方因素行IVF-ET助孕的女性志愿者作为健康对照组。患者年龄分布,病程,不孕类型,基础FSH、LH、E2,差异无统计学意义(P>0.05,见表1)。经山东中医药大学附属医院生殖医学伦理委员会同意(NO.20140214M)。


6  干预方法


6.1  IVF-ET前预处理3组患者皆给予常规IVF-ET前预处理,二至天癸治疗组患者于IVF前1个月经周期始自月经第3天给予二至天癸方(由菟丝子、女贞子、旱莲草、枸杞子、当归、熟地黄、白芍、川芎、制香附及炙甘草组成。每袋 3 g,每盒 12 袋,由山东中医药大学附属医院制剂室提供),每次3 袋,每日2 次,口服,共治疗14 日,2个周期。另两组患者给予安慰剂(主要由糊精组成,由山东中医药大学附属医院制剂室提供)一次 3袋,一日2次,治疗天数同上。


6.2  控制性超促排卵方案(controlled ovarian hyperstim ulation,COH)3组患者均于IVF 周期前1 个月经周期的黄体中期(月经的第 21天左右)根据患者不同情况给予达菲林(GnRH-a,博福-益普生天津制药有限公司;批准文号:H20030577;规格:3.75/mg/支)0.9~1.2mg肌肉注射,自月经周期第3天开始给予重组人促卵泡激素注射液(rFSH,果纳芬,瑞士雪兰诺公司,批准文号:S2013005575;规格:75 IU/支)皮下注射和(或)尿促性腺激素(HMG,丽珠集团丽珠制药厂,规格:75 IU/支)肌注,期间行B超以监测卵泡发育,直至发现有直径≥1.8cm的卵泡≥3个以上,予以人绒毛膜促性腺激素(HCG,丽珠集团丽珠制药厂,规格:5000 IU/支)8000~10000 IU肌肉注射,36h后行取卵术。


6.3  IVF-ET 取卵的同时收集直径为18~20mm卵泡的第一管淡黄色、近透明的卵泡液,标记后液氮罐保存。取卵后行IVF-ET,观察卵细胞、受精及胚胎情况。


7  肾气虚证候积分评价  分别在治疗前和HCG注射日记录治疗组及安慰剂组肾气虚证候积分以及差值。


8  收集颗粒细胞  收集卵泡液。离心(500r/min,10min),留取沉淀。将沉淀物中加入PBS至5mL。取15mL离心管,加入人淋巴细胞分离液5mL,将混悬液缓慢加入淋巴细胞分离液的液面上,离心(1200r/min,20min),吸取在两液面之间的颗粒细胞层PBS离心(3000r/min,5min),下层即为壁颗粒细胞,吸尽PBS,-80℃直接冻存,用于Western blot 实验。


9  卵泡壁颗粒细胞 Pl3K、p-Akt、Bad 蛋白表达检测 采用Western blot 法。将提取的人颗粒细胞加入蛋白裂解液,冰浴30min,使细胞充分裂解。4℃,8000r/min离心10min,收集上清,BCA 法测定蛋白浓度。聚丙炼酸胺凝胶电泳后转膜、封闭,取出已封闭的PVDF 膜,浸于1xTBST 缓冲液中,洗涤5min。然后加入一抗,4℃卵育过夜。用1xTBST漂洗3次次孵育后的PVDF膜,移入含有二抗的小袋中,室温孵育1h。用1xTBST洗膜3次,15min/次。ECL化学发光显影。


10  TUNEL 染色法测细胞凋亡数  随机计数500个颗粒细胞,TUNEL染色阳性细胞的胞浆内呈棕黄色颗粒,阴性细胞呈蓝色;结合细胞凋亡的形态学改变综合判断(阳性细胞出现染色质浓缩,核膜裂解,出现凋亡小体;阴性细胞变小,胞膜完整但有发泡现象)。颗粒细胞凋亡率(%)=阳性细胞数/总的观察细胞数 x 100%。


11  统计学方法  应用SPSS 19.0统计软件进行分析,计量资料以×±S表示,两两比较采用t检验,3组之间均数比较采用 One-Way ANOVA 方差分析。计数资料采用X?检验,组间两两比较采用Bonferro-ni调整检验水准法,检验水准α=0.016P<0.05 为差异有统计学意义。


结   果


1  脱落情况 治疗过程中,由于患者取消周期,部分病例脱落,最后治疗组37例,安慰剂组37例,键康对照组38例完成治疗。


2  治疗组与安慰剂组肾气虚证候积分比较(表2)与本组治疗前比较,治疗组HCG日证候积分降低(P<0.01);与安慰剂组比较,治疗组前后积分差值更高(p<0.01)。

3  3组患者临床妊娠率比较 健康对照组临床妊娠率为60.53%(23/38),安慰剂组为32.43%(12/37),治疗组为62.16%(23/37)。与安慰剂组比较,健康对照组及治疗组临床妊娠率增高(P=0.015,0.010)。


4  3组Pl3K、p-Akt、Bad蛋白表达比较(图1,表3)与健康对照组比较,安慰剂组Pl3K、p-Akt蛋白表达量降低,Bad蛋白表达量升高(P<0.05,p<0.01);与安慰剂组比较,治疗组pl3k、p-akt蛋白表达量升高,bad蛋白表达量降低(p<0.05,p<0.01)。

5  3组患者卵巢颗粒细胞凋亡率比较(表4)健康对照组及治疗组卵巢颗粒细胞凋亡率均明显低于安慰剂组(P<0.01)。

讨 论


肾藏精,为藏精之脏。肾藏精之充沛与否与卵子生长发育密切相关。肾所藏之精气,是卵子生发之本源,为卵母细胞的生成、生长及成熟提供物质基础。肾精肾气充盛,肾之阴阳平衡,相互转化,卵巢才得以“藏泻有时”,产生优质卵并按时发育成熟排出,为孕育胚胎提供前提条件。肾精化肾气,肾气是机体发挥各种功能活动的原动力,肾气又分阴阳,无论阴虚亦或阳虚,均阻碍卵母细胞的生长、发育、成熟及排出,引起不孕。


卵巢颗粒细胞是卵母细胞周围的细胞层,它与卵母细胞间存在着复杂的连接机制,能够调节卵母细胞的发育。HΦst E 等[8]报道卵巢颗粒细胞的凋亡与卵细胞的成熟与受精有关。Raman RS 等[9]研究表明卵细胞的受精能力与颗粒细胞的凋亡有关,Lee KS等[10] 研究也表明颗粒细胞的凋亡状态与IVF-ET患者的获卵数、受精率以及IVF的妊娠结局相关,提示颗粒细胞与IVF-ET患者妊娠结局相关,其凋亡状态可以作为预测IVF-ET的结局的标志之一。颗粒细胞在卵冠丘复合物的成熟过程中存在着凋亡[11-15]。颗粒细胞与卵母细胞相连并对其成熟起作用[8]。IVF-ET过程中,颗粒细胞凋亡率较低的卵母细胞ET后妊娠率更高[16,17]。因此,颗粒细胞的凋亡与卵母细胞的发育成熟相关[8,13]。


Pl3K/Akt信号通路是影响细胞凋亡通路最主要的一条,其机制为Pl3K扩增及Akt的过度活化[18]。目前,以Pl3K/Akt信号通路关键效应分子及靶基因p-Akt、Pl3K、Bad为靶点的凋亡抑制正在成为研究的热点[[19]。卵巢中颗粒细胞的凋亡与普通细胞存在相似之处,但也有自己独特的调控模式。已知与颗粒细胞凋亡相关的因素包括基因、细胞因子等[20]。其中基因的参与尤为重要。Bcl-2家族在颗粒细胞凋亡的调控中起着决定性作用[ 21 ]。研究显示,Bcl-2能够抑制颗粒细胞凋亡,而Bad蛋白能够拮抗Bcl-2的生物学活性[ 22 ]。


本研究结果显示:二至天癸方治疗组治疗后肾气虚症状较治疗前明显改善,证候积分降低(P<0.01);二至天癸方治疗组获卵数、获胚数较安慰剂组均较高P<0.01),二至天癸治疗组的临床妊娠率(62.16%)高于安慰剂组(32.43%,P<0.05);与安慰剂组比较,治疗组Pl3K、p-Akt蛋白表达量升高,Bad蛋白表达量降低(P<0.05,P<0.01);治疗组卵巢颗粒细胞凋亡率较安慰剂组低(P<0.01)。表明二至天癸方可明显改善肾气虚 IVF 女性肾虚状态,提高其临床妊娠率,其可能是通过Pl3K/Akt通路下调Bad 水平表达,抑制颗粒细胞的凋亡,从而改善肾气虚型不孕症患者卵细胞质量,提高其IVF-ET成功率。


二至天癸方以“补肾调冲任”的立法之本,能够提高IVF-ET患者卵子质量,改善子宫内膜容受性,从而提高不孕症患者的妊娠率。菟丝子补益肾精,既可补阳,又可益阴,女贞子、枸杞子、旱莲草滋补肝肾,熟地黄养阴补血、滋养精髓,川芎活血调经,当归补血调经,白芍养血敛阴,香附疏肝解郁,全方共奏补益肝肾,调理冲任之功,使肾中阴平阳秘,精血俱旺,肾精充盛,血海按期满盈,则胎孕可成。Pl3K/Akt信号通路的配体还包括Foxo3a、P21、P 27 等[ 23 ],二至天癸方是否能通过增加Akt的表达而调控其他因子如Foxo3a等的信号转录,还有待于进一步研究。


参考文献(略)